Planta de Brassica que comprende un alelo INDEHISCENT mutante.

Una planta de Brassica que comprende al menos dos genes IND en dos loci,

o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizada por que comprende al menos dos alelos IND mutantes en un locus en su genoma, en la que dichos alelos IND mutantes son alelos mutantes de un gen que codifica una proteína IND funcional, en la que el gen IND funcional comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a. una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 7; y

b. una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta el aminoácido en la posición 210 o SEC ID NO: 4,

en la que dichos alelos IND mutantes comprenden una región de ADN mutada que consiste en uno o más nucleótidos insertados, suprimidos o sustituidos en comparación con una región de ADN de tipo salvaje correspondiente en el gen IND funcional, y en la que dichos alelos IND mutantes no codifican una proteína IND funcional.

Planta de Brassica que comprende un alelo INDEHISCENT muíante CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al campo de productos agrícolas, especialmente plantas de cultivo, particularmente de la familia Brass/caceae, en particular la especie de Brass/ca, de las cuales se modulan las propiedades de dehiscencia del fruto. Más específicamente, la invención se refiere a métodos y medios mejorados para reducir el desgranado de la semilla, o retrasar el desgranado de la semilla hasta después de la cosecha, en plantas tales como plantas Brass/caceae, particularmente plantas Brass/caceae que se hacen crecer para la producción de semillas, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas. Se describen moléculas de ácidos nucleicos tanto de tipo salvaje como mutantes que codifican proteínas INDEHISCENT (IND) de Brass/ca, y las proteínas como tales. También se proporcionan plantas de Brass/ca que comprenden al menos dos genes //VD, en particular plantas de Brass/ca napas, y células, partes, semillas y progenie de las mismas, caracterizadas por que comprenden tres alelos /nd mutantes completamente genosuprimidos en su genoma, promedio de lo cual se alteran significativamente las propiedades de dehiscencia del fruto. Además, se describen aquí métodos para generar plantas de Brass/ca en las que se reduce el desgranado de semillas, o en el que se retrasa el desgranado de semillas hasta después de la cosecha, mientras que se mantiene preferiblemente una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas, como también se describen vainas de semillas y semillas obtenibles a partir de tales plantas. Se proporcionan además métodos para detectar la presencia de uno o más alelos /nd mutantes y/o alelos //VD de tipo salvaje en plantas según la invención. También se describen métodos para transferir uno o más alelos /nd mutantes y/o alelos //VD de tipo salvaje a otras plantas, y métodos para combinar diferentes alelos /nd y/o //VD en plantas. En particular, métodos para combinar un número adecuado de alelos /nd mutantes, que codifican proteínas no funcionales o no IND y/o proteínas IND que tienen actividad significativamente reducida /n v/vo, de tal manera que se reduzca significativamente el desgranado de las semillas, o retrase el desgranado de las semillas hasta después de la cosecha, a la vez que mantienen al mismo tiempo una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas. Además de los usos de las plantas, o sus partes, y/o su progenie, se describen semillas y aceites de semilla, y los métodos y/o kits de la invención. También se describen métodos y medios para incrementar la productividad, particularmente la productividad de granos y semillas. El fenotipo de incremento de la productividad se puede separar del fenotipo de desgranado reducido o retrasado de semillas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las silicuas o vainas de plantas de Brass/ca liberan sus semillas a través de un proceso denominado dehiscencia del fruto. Una silicua consiste en dos carpelos unidos margen con margen. La sutura entre los márgenes forma un nervio grueso, denominado replum. A medida que se acerca la madurez en las vainas, las dos valvas se separan progresivamente del replum, a lo largo de líneas designadas de debilidad en la vaina, dando eventualmente como resultado el desgranado de las semillas que estaban unidas al replum. La zona de dehiscencia define la localización exacta de la disociación de las valvas.

El desprendimiento de la semilla (también denominado como "desgranado de la semilla" o "desgranado de la vaina") por vainas maduras antes o durante la cosecha del cultivo es un fenómeno universal con cosechas que desarrollan frutos dehiscentes secos. El desgranado prematuro de semillas da como resultado una recuperación reducida de semillas, lo que representa un problema en cultivos que se hacen crecer principalmente para las semillas, tales como plantas de Brass/ca productoras de aceite, particularmente colza. Otro problema relacionado con el desgranado prematuro de las semillas es un incremento en el crecimiento voluntario en el año subsiguiente de cultivo. En colza, las pérdidas de productividad relacionadas con el desgranado de las vainas son de media 20% (Child et al., 1998, J Exp Bot 49: 829-838), pero pueden alcanzar hasta 50%, dependiendo de las condiciones meteorológicas (MacLeod, 1981, Harvesting in Oilseed Rape, p. 107-120 Cambridge Agricultura! Publishing, Cambridge).

Las variedades comerciales actuales de colza son extremadamente susceptibles al desgranado. Hay poca variación para la resistencia al desgranado dentro de los programas de cultivo de B. napus existentes, pero se han encontrado líneas resistentes dentro de los progenitores diploides de B. napas (B. o/eracea y B. rapa) así como dentro de otros miembros del género de Brass/ca, principalmente B. júncea, B. cannafa y B. n/gra. Kadkol et al. (1986, Aust. J. Botany 34 (5): 595-601) dan a conocer una mayor resistencia frente al desgranado en ciertos registros de B. campesfns que estaba asociada con la ausencia de una capa de separación en la región de unión de valvas de silicua al replum. Prakash y Chopra (1988, Plant breeding 101: 167-168) describen la introgresión de la resistencia al desgranado en Brass/ca napus desde Brass/ca júncea mediante recombinación no homologa. Spence et al. (1996, J of Microscopy 181: 195-203) describen que algunas líneas de Brass/ca júncea muestran una tendencia reducida a desgranarse en comparación con líneas de Brass/ca napus. Morgan et al., 1998 (Fields Crop Research 58, 153-165) describen variación genética para la resistencia al desgranado de vainas entre líneas de colza desarrolladas a partir de B. napus sintético, y concluyen que las líneas que requirieron mucha energía para abrir sus vainas parecieron tener una mayor vascularización en la zona de dehiscencia y una degradación reducida de la pared celular en la zona de dehiscencia. Encontraron además una correlación negativa significativa entre la longitud del pico de las vainas y la fuerza necesaria para provocar el desgranado de las vainas. Child y Huttly (1999, Proc 10th Int.

Rapeseed Congress) describen la variación en la maduración de vainas en B. napas muíante Inducida por irradiación y una población de sus variedades de cultivo progenltoras, Jet Neuf, en la que las plantas de tipo salvaje y mutantes más resistentes mostraron una gran lignificación de grupos de células a lo largo de la zona de dehiscencia, y en la que se describieron trazas vasculares situadas próximas al borde Interno de la zona de dehiscencia en el muíante, para ayudar a asegurar las valvas. Child et al. (2003, J Exp Botany 54 (389): 1919-1930) describen además la asociación entre una mayor resistencia al desgranado de las vainas y cambios en la estructura vascular en vainas de una línea de Brass/ca napas resintetizada. Sin embargo, los métodos tradicionales para el cultivo no han tenido éxito a la hora de introducir resistencia al desgranado en variedades de cultivo de colza, sin interferir con otros rasgos deseables tales como floración temprana, maduración y resistencia al pie negro (Prakash y Chopra, 1990, Genetical Research 56: 1-2).

Se han identificados varios genes, que promueven o inhiben la dehiscencia de las vainas, en Arab/dops/s fba//'ana a través del análisis de mutantes: mutantes combinados tanto en S/-//tí7*ERPROOFf (S/-/P1; inicialmente denominado como AGL1) como en SP/tí7*EPPPOOP2 (S/-/P2; inicialmente denominado como AGL5) dan como resultado silicuas ¡ndehlscentes (es decir, silicuas que permanecen cerradas con la maduración en Arab/dops/s fba//ana) (Liljegren et al., 2000, Nature 404, 766-770). De forma similar, mutantes en el gen //VDEP/SCSVÍ (denominado //VD1) en Arab/'dops/'s fba//ana (Liljegren et al., 2004, Cell 116: 843-853; publicación PCT WO 01/79517), así como en /ÍLC.47P.4Z (denominado como ALC; Rajani et al. 2001, Current Biology 11, 1914-1922) interfirieron con la dehiscencia de las vainas, conduciendo a resistencia al desgranado de las vainas. La expresión constitutiva de FPU/7FUL (FUL), un represor de SHP e //VD, en Arab/dops/s fba//ana, también dio como resultado silicuas indehiscentes (Ferrandiz et al., 2000, Science, 289, 436-438). Se cree que estos factores de transcripción forman una red transcrlpclonal no lineal que controla la identidad del margen de la valva y el desgranado de las vainas. Liljegren et al. (2004, Cell 116: 843-853) describen además que //VD, un gen de hélice-bucle-hélice básica (bHLH) atíplco, dirige la diferenciación del margen de la valva en las capas de separación y lignificadas en Arab/dops/s fba//ana. La capa de células lignificadas adyacente a la capa de separación junto con la capa b del endocarpio (una única capa de células... [Seguir leyendo]

1. Una planta de Brass/ca que comprende al menos dos genes //VD en dos loci, o una célula, parte, semilla o progenie de la misma, caracterizada por que comprende al menos dos alelos //VD mutantes en un locus en su genoma, en la que dichos alelos //VD mutantes son alelos mutantes de un gen que codifica una proteína IND funcional, en la que el gen /NO funcional comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a. una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 7; y

b. una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta el aminoácido en la posición 210 o SEC ID NO: 4,

en la que dichos alelos IND mutantes comprenden una región de ADN mutada que consiste en uno o más nucleótidos insertados, suprimidos o sustituidos en comparación con una región de ADN de tipo salvaje correspondiente en el gen IND funcional, y en la que dichos alelos IND mutantes no codifican una proteína IND funcional.

2. La planta de la reivindicación 1, en la que dichos alelos //VD mutantes son alelos //VD en los que el codón de aminoácidos que corresponde a la posición 122 en SEC ID NO: 2, a la posición 50 en SEC ID NO: 4 o a la posición 135 en SEC ID NO: 4 está sustituido por un codón de PARADA, o en la que los codones ASP y ARG que corresponden a la posición 103 y 127 en SEC ID NO: 2, respectivamente, están sustituidos por codones ASN y HIS.

3. La planta de la reivindicación 1, caracterizada por que comprende al menos tres alelos //VD mutantes en su genoma, en la que dichos alelos //VD mutantes son alelos mutantes de un gen que codifica una proteína IND funcional, en la que el gen //VD funcional comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a. una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 46 hasta el nucleótido en la posición 633, SEC ID NO: 3,

SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 7; y

b. una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 desde el aminoácido en la posición 16 hasta el aminoácido en la posición 210 o SEC ID NO: 4,

en la que dichos alelos IND mutantes comprenden una región de ADN mutada que consiste en uno o más nucleótidos insertados, suprimidos o sustituidos en comparación con una región de ADN de tipo salvaje correspondiente en el gen IND funcional, y en la que dichos alelos IND mutantes no codifican una proteína IND funcional.

4. La planta según la reivindicación 3, en la que dichos alelos //VD mutantes son alelos //VD en los que el codón de aminoácidos que corresponde a la posición 122 en SEC ID NO: 2, a la posición 50 en SEC ID NO: 4 o a la posición 135 en SEC ID NO: 4 está sustituido por un codón de PARADA, o en los que los codones ASP y ARG que corresponden a la posición 103 y 127 en SEC ID NO: 2, respectivamente, están sustituidos por codones ASN y HIS.

5. La planta según la reivindicación 3 o 4, en la que el desgranado de semillas de la planta está significativamente reducido o retrasado en comparación con el desgranado de semillas de una planta correspondiente que no comprende alelos //VD mutantes.

6. La planta según la reivindicación 5, que mantiene una capacidad de trilla agronómicamente relevante de las vainas.

7. La planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la productividad de semillas de la planta está incrementada, preferiblemente significativamente incrementada en comparación con la productividad de semillas de una planta correspondiente que no comprende alelos //VD mutantes.

8. Una vaina de semillas obtenible de una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la semilla de la vaina de semillas comprende al menos dos alelos IND mutantes como se describe en la reivindicación

1 o 2.

9. Un método para detectar la presencia de al menos dos alelos //VD mutantes en una planta de Brass/ca, comprendiendo dicho método identificar al menos dos alelos //VD mutantes como se describe en la reivindicación 1 o

2 en una muestra biológica, en el que un alelo //VD mutante se identifica determinando la presencia de la región de ADN mutada del alelo IND mutante en un ácido nucleico presente en la muestra biológica.

10. El método según la reivindicación 9, que comprende además someter la muestra biológica a una reacción en cadena de la polimerasa o un ensayo de hibridación usando un conjunto de dos cebadores o sondas, seleccionándose dicho conjunto del grupo que consiste en:

- un conjunto de cebadores o sondas, en el que uno de dichos cebadores o sondas reconoce específicamente una región de ADN que fianquea en 5' la región de ADN mutada del alelo //VD mutante, y el otro de dichos cebadores o sondas reconoce específicamente una región de ADN que flanquea en 3' la región de ADN mutada del alelo //VD mutante,

- un conjunto de cebadores o sondas, en el que uno de dichos cebadores o sondas reconoce

específicamente una región de ADN que flanquea en 5' o en 3' la reglón de ADN mutada del alelo //VD

mutante, y el otro de dichos cebadores o sondas reconoce específicamente la región de ADN mutada del alelo //VD mutante,

- un conjunto de cebadores o sondas, en el que uno de dichos cebadores o sondas reconoce

específicamente una región de ADN que flanquea en 5' o en 3' la reglón de ADN mutada del alelo //VD

mutante, y el otro de dichos cebadores o sondas reconoce específicamente la región de unión entre la reglón de flanqueo en 3' o en 5' y la región de ADN mutada del alelo //VD mutante, respectivamente, y

- una sonda que reconoce específicamente la región de unión entre una reglón de ADN que flanquea en 5' o en 3' la región de ADN mutada y la reglón de ADN mutada del alelo //VD mutante.

11. El método según la reivindicación 10, en el que

- dicha reglón de ADN de flanqueo en 5' o en 3' comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 5 desde el nucleótldo 1 al 923 o 925 al 1622 o de su complemento, respectivamente; dicha región de ADN mutada tiene la secuencia nucleotídica de nucleótldo 924 de SEC ID NO: 5 o de su complemento; y dicha región de unión comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 924 o 924 al 1622 o de su complemento, respectivamente, o

- dicha reglón de ADN de flanqueo en 5' o en 3' comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 5 desde el nucleótldo 1 al 866 u 868 al 1622 o de su complemento, respectivamente, o de SEC ID NO: 5 desde el nucleótldo 1 al 939 o 941 al 1622 o de su complemento, respectivamente; dicha reglón de ADN mutada tiene la secuencia nucleotídica de nucleótido 867 de SEC ID NO: 5 o de su complemento, o de nucleótido 940 de SEC ID NO: 5 o de su complemento; y dicha región de unión comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 867 u 867 al 1622 o de su complemento, o de SEC ID NO: 5 desde el nucleótido 1 al 940 o 940 al 1622 o de su complemento, respectivamente, o

- dicha región de ADN de flanqueo en 5' o en 3' comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 643 o 645 al 1593 o de su complemento, respectivamente; dicha región de ADN mutada tiene la secuencia nucleotídica de nucleótido 644 de SEC ID NO: 7 o de su complemento; y dicha región de unión comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 644 o 644 al 1593 o de su complemento, respectivamente, o

- dicha región de ADN de flanqueo en 5' o en 3' comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 898 o 900 al 1593 o de su complemento, respectivamente; dicha región de ADN mutada tiene la secuencia nucleotídica de nucleótido 899 de SEC ID NO: 7 o de su complemento; y dicha región de unión comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 7 desde el nucleótido 1 al 899 u 899 al 1593 o de su complemento, respectivamente.

12. El método según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho conjunto de cebadores o sondas se selecciona del grupo que consiste en:

- un conjunto de cebadores que comprende un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 13 y/o un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 15,

- un conjunto de cebadores que comprende un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 16 y/o un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 18,

- un conjunto de cebadores que comprende un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 19 y/o un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 21,

- un conjunto de cebadores que comprende un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 22 y/o un cebador que comprende la secuencia de SEC ID NO: 24,

- un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 25 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 26,

- un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 28 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 29,

- un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 31 y/o una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 32, y

5 - un conjunto de sondas que comprende una sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 34 y/o una

sonda que comprende la secuencia de SEC ID NO: 35.