Un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina,

dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características:

(i)es capaz de unirse a la molécula HLA-A1 de clase I con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) que es como máximo de 50 µM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA

(ii)es capaz de inducir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii)es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido epítopo

Péptidos derivados de survivina y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos derivados de survivina, y a su uso para propósitos diagnósticos y terapéuticos, específicamente en cáncer. En particular, los péptidos nuevos son epítopos de células T restringidos a HLA-A1 de MHC de clase I que son capaces de provocar respuestas de células T citotóxicas en pacientes de cáncer, incluyendo respuestas in situ y ex vivo. De una manera específica, tales péptidos nuevos derivan de la proteína inhibidora de apoptosis survivina, un reconocido antígeno asociado a tumor (TAA).

Antecedentes técnicos y técnica anterior

El proceso mediante el cual el sistema inmune de mamíferos reconoce y reacciona a los materiales extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de células T. Esta respuesta requiere que las células T reconozcan e interaccionen con complejos de moléculas de la superficie celular denominados antígenos leucocitarios humanos (HLA), que constituyen el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, y péptidos. Los péptidos derivan de moléculas más grandes, que son procesadas por las células, que también presentan la molécula HLA/MHC. La interacción de las células T y complejos HLA/péptido está restringida, requiriendo una célula T que es específica para una combinación particular de una molécula de HLA y un péptido. Si no está presente una célula T específica, no hay respuesta de células T, incluso si está presente su complejo asociado. De una manera similar, no hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula T está presente.

El mecanismo mediante el cual las células T reconocen las anormalidades celulares también se ha implicado en cáncer. Por ejemplo, en WO 92/20356, se da a conocer una familia de genes que se procesan a péptidos, que a su vez se expresan en las superficies celulares, y pueden producir lisis de las células tumorales por CTL específicos. Estos genes se denominan la familia MAGE, y se dice que codifican para "precursores de antígeno de rechazo tumoral" o moléculas "TRAP", y los péptidos derivados de los mismos se denominan "antígenos de rechazo tumoral" o moléculas "TRA".

En WO 94/05304, se dan a conocer nonapéptidos que se unen a la molécula HLA-A1. La referencia da a conocer que dada la especificidad conocida de péptidos particulares para moléculas de HLA particulares, se debe esperar que un péptido particular se una a una molécula de HLA, pero no a otras. Esto es significativo, porque diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA. Como resultado, aunque la identificación de un péptido particular como que es un asociado para una molécula de HLA específica tiene ramificaciones diagnósticas y terapéuticas, éstas solamente son pertinentes para los individuos con ese fenotipo de HLA particular.

Se han caracterizado varios péptidos presentados por las moléculas de MHC, y se ha encontrado que algunos de éstos pueden llevar modificaciones postraduccionales que posiblemente tengan un impacto sobre la funcionalidad del complejo HLA-péptido. De esta manera, un número de estudios han asociado las alteraciones en el patrón de fosforilación con la transformación maligna. Además, se ha mostrado que la fosforilación podría tener un efecto neutro, negativo, o incluso positivo, sobre la unión del péptido al MHC de clase I, y que se podrían generar CTL específicos de fosfopéptido, que discriminarían entre las versiones fosforilada y no fosforilada del péptido, mostrando que tales CTL lo más probablemente sean parte del repertorio de CTL restringidos a MHC de clase I. Recientemente, se ha mostrado que los péptidos fosforilados realmente son procesados de una forma natural y presentados por las moléculas de MHC de clase I in vivo. Adicionalmente, se ha establecido la presencia de péptidos fosforilados en extractos de moléculas de clase I aisladas de varias células B transformadas por diferentes EBV.

De esta manera, está bien establecido que los epítopos peptídicos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) pueden ser reconocidos como antígenos por los linfocitos T citotóxicos (CTL) en el contexto de las moléculas de MHC (1). Sin embargo, aunque en general se acepta que la mayoría de, si no todos, los tumores son antigénicos, solamente unos cuantos son en realidad inmunogénicos en el sentido de que la evolución del tumor la controla fácilmente el sistema inmune.

Para superar esta limitación, se han iniciado varios ensayos inmunoterapéuticos, por ejemplo vacunaciones con péptidos derivados de TAA. Para melanoma, el tumor para el que se ha caracterizado el mayor número de TAA definidos por CTL, se han inducido poderosas respuestas de CTL contra los antígenos mediante vacunación y algunos pacientes experimentaron una remisión completa de su enfermedad (2,3). Sin embargo, la mayoría de los epítopos peptídicos utilizados en estos ensayos de vacunación son específicos del melanocito, y estos péptidos no se pueden aplicar para tumores de origen no melanocítico. Además, la expresión de estos TAA es heterogénea entre tumores de diferentes pacientes, e incluso puede variar entre las metástasis obtenidas de un paciente. Sin embargo, durante el último par de años, se han identificado un número de antígenos peptídicos específicos de tumores, que se expresan en un número de cánceres diferentes, es decir, HER-2 (4), Muc-1 (5) y telomerasa (6).

También se ha mostrado que mediante la manipulación apropiada los antígenos tumorales presentes en los tumores se pueden exponer al sistema inmune. Estudios han mostrado que el brazo CTL CD8+ de la respuesta inmune, solo o en combinación con las células T_h CD4+, constituye el brazo efector anti-tumoral primario de la respuesta inmune adaptativa. Hasta ahora, el enfoque ha estado principalmente sobre el brazo CTL de la respuesta inmune. Sin embargo, cada vez está más claro que la respuesta de células T CD4 desempeña un papel esencial en el rechazo del tumor, en especial en la fase de inducción o en la extensión de una respuesta de CTL in vivo. Por consiguiente, la incorporación de antígenos tumorales restringidos a la clase II en protocolos de vacunación de tumores eficaces, podría aumentar la eficacia de las vacunas.

La apoptosis es un programa genético de suicidio celular, y se ha sugerido que la inhibición de la apoptosis es un mecanismo importante involucrado en la formación de cáncer mediante la extensión del lapso de vida de las células, que favorece la acumulación de mutaciones transformantes (7). La survivina es un miembro recientemente identificado de la familia de inhibidores de las proteínas de apoptosis (IAP). En un análisis de expresión genética global de aproximadamente 4 millones de transcritos, se identificó la survivina como uno de los genes principales invariablemente aumentados en muchos tipos de cáncer, pero no en tejido normal (8). Los tumores malignos sólidos que sobreexpresan survivina incluyen cáncer de pulmón, colon, mama, páncreas y próstata, así como tumores malignos hematopoyéticos (9). Adicionalmente, se han descrito series de melanomas y cánceres de piel no melanoma como invariablemente positivos para survivina (10, 11). La sobreexpresión de survivina en la mayoría de los cánceres humanos sugiere un papel general de inhibición de la apoptosis en la evolución del tumor, una noción sustanciada por la observación de que en el caso del cáncer colorrectal y de vejiga, así como en neuroblastoma, la expresión de survivina estaba asociada con un pronóstico desfavorable. Por el contrario, la survivina es indetectable en tejidos adultos normales. Estas características califican a la survivina como un TAA adecuado tanto para fines diagnósticos como terapéuticos.

Por consiguiente, durante la última década se han identificado un gran número de TAA que son reconocidos por CTL de una forma restringida al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Debido a que la survivina se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres humanos y la inhibición de su función produce un aumento de la apoptosis, esta proteína puede servir como una diana para las respuestas terapéuticas de CTL. La proteína survivina y el potencial uso diagnóstico y terapéutico de la misma se dan a conocer en (8) y en US 6245523. La survivina es una proteína citoplásmica de 16,5 kDa que contiene un único BIR y una región carboxi-terminal enrollada altamente cargada en lugar de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por la retirada de factor de crecimiento (IL-3) cuando se transfiere...

1. Un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características:

2. Un péptido según la reivindicación 1 que tiene un valor C₅₀, que es como máximo de 30 µM.

3. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que tiene un valor C₅₀, que es como máximo de 20 µM.

4. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende como máximo 20 restos de aminoácidos.

5. Un péptido según la reivindicación 4 que comprende como máximo 10 restos de aminoácidos.

6. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es capaz de inducir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 10⁴ PBL.

7. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de inducir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

8. Un péptido según la reivindicación 7 donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de cólon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

9. Un péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de inducir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa, dichas células productoras de IFN-? tienen efecto citotóxico contra células que expresan survivina de una línea celular de cáncer, incluyendo una línea celular seleccionada del grupo que consiste en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y la línea celular de melanoma FM3.

10. Una composición farmacéutica que comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10, dicha composición comprende una combinación de dos o más péptidos epítopos restringidos a MHC de clase I derivados de survivina, que interacciona cada uno de forma específica con una molécula de HLA diferente y que tienen al menos una de las siguientes características:

12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde cada péptido epítopo interacciona de forma específica con una molécula HLA-A de MHC de clase I, una molécula HLA-B de MHC de clase I o una molécula HLA-C de MHC de clase I.

13. Una composición farmacéutica según la reivindicación 12, en donde dicha molécula HLA-A de MHC de clase I incluye HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28).

14. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde dicha molécula HLA-B de MHC de clase I incluye cualquiera de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47.

15. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde dicha molécula HLA-C de MHC de clase I incluye cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 y HLA-Cw16.

16. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-15 que comprende un péptido epítopo, que es una secuencia nativa de survivina de una especie de mamífero.

17. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, que comprende un péptido epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 66.

18. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende un péptido epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 58.

19. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en donde los dichos péptidos epítopo son capaces de inducir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 10⁴ PBL.

20. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11-19, en donde dichos péptidos epítopos son capaces de inducir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

21. Una composición farmacéutica según la reivindicación 20, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

22. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-21, que comprende un péptido epítopo que está modificado postraduccionalmente.

23. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-22, que comprende un péptido fosforilado.

24. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-23 que comprende un adyuvante.

25. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10-24, que es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia de células T que reaccionan con survivina entre PBL o en tejido tumoral.

26. Una vacuna multiepítopo que comprende un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características:

27. Una vacuna multiepítopo según la reivindicación 26, que incluye una combinación de epítopos peptídicos derivados de survivina que dependen del tipo de tejido del paciente determinado.

28. Una vacuna multiepítopo según la reivindicación 26 ó 27, en donde la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune contra una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

29. Una vacuna multiepítopo según la reivindicación 28, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

30. Una vacuna multiepítopo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en donde la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas.

31. Uso de un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

32. Uso según la reivindicación 31, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

33. Uso de un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con tratamiento convencional contra el cáncer tal como radioterapia o quimioterapia.