Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos.

Utilización de un péptido de fórmula

en el que X1 y X2 pueden ser idénticos o diferentes y representan independientemente cualquier aminoácidodiferente de arginina;

n es 0 ó 1; y

R representa arginina,

en el que dicho péptido muestra una actividad biológica de peptona para inducir el crecimiento celular y/o ladensidad celular y/o la viabilidad celular y/o la eficacia de producción de polipéptidos heterólogos en cultivos dehuéspedes recombinantes.

Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la separación, identificación y caracterización de fragmentos de péptidos activos de peptonas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los hidrolizados de tejidos de animales y plantas se añaden a menudo a medios de cultivo para reforzar en las procariotas y eucariotas el número de células viables y el título de productos proteicos recombinantes. De este modo, se han utilizado ampliamente las peptonas de diversas fuentes en formulaciones de medios de cultivo celular para aumentar el crecimiento, la longevidad y la productividad del cultivo celular. Sin embargo, su presencia como aditivos del medio para la producción de proteínas terapéuticas presenta varios desafíos debido a su naturaleza no definida.

La utilización de componentes derivados de animales como aditivos del medio para la producción de proteínas terapéuticas por células de mamíferos pueden causar contaminaciones virales, por micoplasma y priones (Kallel et al., J. Biotechnol. 95:195-204 (2002) ) . El esfuerzo para evitar la utilización de componentes derivados de animales en medios de cultivo celular está apoyado por las autoridades reguladoras europeas y americanas (Castle y Roberston, Dev. Biol. Stand. 99:191-196 (1999) ) . En las últimas décadas se ha eliminado satisfactoriamente el suero de animal y la mayoría de los medios utilizados actualmente se certifican como libres de proteínas (Froud, Dev. Biol. Stand. 99:157-166 (1999) ) . Sin embargo, el cambio a medios libres de proteínas da lugar a menudo a una pérdida de crecimiento y productividad celular (Lee et al., J. Biotechnol. 69:85-93 (1999) ) .

Como resultado, los hidrolizados de proteínas (también conocidos como peptonas) se utilizan frecuentemente en medios de cultivo celular como aditivos de nutrientes porque algunos de ellos se pueden considerar como libres de proteínas 25 (Burteau et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Anim. 39 (7) :291-296 (2003) , US-A1-2004/0138428, EP-A20810283 y "BD Bionutrients Technical Manual" Tercera revisión revisada (2006) BD BIOSCENCE) . Las peptonas para el cultivo celular se fabrican habitualmente mediante digestión enzimática de un conjunto de materiales de partida de base biológica: tejidos de animales, productos derivados de la leche, microorganismos o plantas.

El efecto general de las peptonas es un aumento del crecimiento celular y un incremento de la productividad, con la misma calidad de producto en comparación con el medio estándar (Jan et al., Cytotechnology 16:17-26 (1994) ; Heidemann et al., Cytotechnology 32:157-167 (2000) ; Sung et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:527-536 (2004) ) . Varios artículos han demostrado que las peptonas contienen materiales, tales como aminoácidos libres, oligopéptidos, sales de hierro, lípidos y elementos traza (Franck et al., Biotechnol. Prog. 16:688-692 (2000) ; Martone et al., Bioresour. Technol. 96:383-387 (2005) ) . Un estudio investigó las funciones potenciales de las peptonas y mostró que pueden tener un efecto nutricional (Heidemann et al., Cytotechnology 32:157-167 (2000) . Además, Schlaeger, J. Immunol. Meth. 194:191-199 (1996) , demostraron que un hidrolizado de proteínas particulares muestra propiedades contra la apoptosis.

A pesar de las numerosas investigaciones sobre los efectos de las peptonas en el cultivo celular, su mecanismo de acción aún es desconocido. Aunque las peptonas han demostrado ser beneficiosas en los procesos de cultivo celular, su uso también tiene muchas desventajas. En primer lugar, dado que algunas peptonas derivan de animales, se encuentran problemas similares que con el uso de suero. Además, las peptonas de otras fuentes también pueden ser una potencial fuente de agentes accidentales. En segundo lugar, la incertidumbre de los componentes “activos” en la peptona y su mecanismo de acción dificulta, si no imposibilita, tener una medición de la calidad en los lotes de peptonas utilizados en los procesos de fabricación de cultivos celulares. Finalmente, dado que los materiales de origen y los procesos en la fabricación de peptonas no están normalizados ni son generalmente intercambiables, las propias peptonas son por naturaleza una materia prima de origen único. Por lo tanto, existe la oportunidad de caracterizar mejor las peptonas a efectos de reducir o eliminar estas desventajas.

Por lo tanto, sería ventajoso entender la composición e identidad de los componentes activos en las peptonas a efectos de crear “medios definidos”, que comprendan componentes activos bien especificados en concentraciones reproducibles bien definidas. Además se espera que la identificación de componentes activo de peptonas conduzca a un mejor entendimiento de la fisiología de células huésped y líneas celulares recombinantes al abrir una ventana al control del crecimiento y la muerte celular y un mejor control de la expresión de proteínas recombinantes.

Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para caracterizar composiciones de peptonas y para entender los mecanismos de sus efectos en los cultivos celulares.

La presente invención se basa en el fraccionamiento de una peptona derivada de animal, PP3, en componentes identificables y, mediante la aplicación de técnicas analíticas modernas que incluyen la espectrometría de masas de alta resolución, el estudio de la naturaleza de estos compuestos. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el reconocimiento de que dipéptidos y tripéptidos que terminan en arginina juegan un papel en las actividades de inducción del crecimiento y el título de PP3.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención es tal como se establece en las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es la ilustración esquemática del fraccionamiento y análisis de PP3, tal como se describe en el ejemplo.

La figura 2 muestra los resultados de la cromatografía de fase inversa C18.

La figura 3 muestra los resultados de la cromatografía de la fracción que pasa por C18 (no unida) . “Actividad específica relativa” se define como la actividad de un peso igual de la fracción dividida por la de PP3.

Las figuras 4A y 4B muestran que la actividad específica del material purificado por G-15 (fracciones F3-F7) se incrementó significativamente sobre la de PP3 con respecto a su capacidad de incrementar el título de proteína recombinante (figura 3A) y el recuento de células viables (VCC; figura 3B) .

Figura 5. Análisis espectral de masas de la fracción de G-15. Panel superior: Rastreo MS de la fracción. Paneles inferiores: análisis ms/ms de m/z 403, 2, 389, 2 y 375, 2, respectivamente.

Figura 6. Distribución de frecuencia de los péptidos en una biblioteca de tripéptidos in silico que terminan en R. Eje X: masa de tripéptidos; Eje Y: frecuencia a cada masa.

Figuras 7A y B. Efectos de PP3 y péptidos XXR sobre el VCC y el título de producto. A. VCC medido en el bioensayo en respuesta a la adición de concentraciones crecientes de PP3 (línea negra) o péptidos XXR (línea roja) .

B. Título de producto medido en el bioensayo en respuesta a la adición de concentraciones crecientes de PP3 (línea negra) o péptidos XXR (línea roja) .

Figura 8. Secuencia de aminoácidos del componente 3 del polipéptido proteosa peptona (PP3) bovino (SEQ ID NO: 1) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A. Definiciones [0012] A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que lo entendido habitualmente por un experto en la materia al que pertenece la invención. Singleton et al., Dictionar y of Microbiology and Molecular Biology 2ª edición, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994) proporciona a un experto en la material una guía general para muchos términos utilizados en la presente solicitud.

El término “peptona” se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio e incluye derivados de proteínas solubles en agua obtenidas mediante la hidrólisis parcial de proteínas, y mezclas de los mismos, que incluyen, sin limitación, mezclas de hidrolizados derivados del tejido de mucosa de cerdo, ganado y otros animales, producidos mediante hidrólisis con enzimas proteolíticas, así como hidrolizados de varios tejidos de plantas. El término incluye específicamente, sin limitación, el componente 3 de peptona proteasa (PP3) , también denominado lactoforina, que es una fosfoglicoproteína menor de 153 residuos (Sorensen y Sorensen, J. Dair y Res. 60:535-542 (1993) ) hallada en la leche bovina (número de acceso en la base de datos... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un péptido de fórmula

(X1) nX2R

en el que X1 y X2 pueden ser idénticos o diferentes y representan independientemente cualquier aminoácido diferente de arginina; n es 0 ó 1; y

R representa arginina, en el que dicho péptido muestra una actividad biológica de peptona para inducir el crecimiento celular y/o la densidad celular y/o la viabilidad celular y/o la eficacia de producción de polipéptidos heterólogos en cultivos de huéspedes recombinantes.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido se obtiene mediante el fraccionamiento de una peptona o se sintetiza químicamente.

3. Utilización, según la reivindicación 2, en la que dicha peptona que se fracciona es una peptona PP3 (componente 3 de la proteasa peptidona) . 20

4. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido se selecciona entre los péptidos DIR, DLR, EVR, DPR, TVR, EIR, ELR, INR, LNR, QVR, AVR, GIR, GLR, IVR, LVR, ITR, LTR, DTR, ESR, GGR, DVR, IIR, ILR, LLR, AIR, ALR, ADR, EGR, AGR, DQR, ENR, DMR, EMR, ASR, GTR, IMR, FPR, LMR, IPR, LPR, IR, LR, PR, DR, VR, SR, AR, ER, MR, NR, QR, y GR.

5. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido es un tripéptido.

6. Utilización, según la reivindicación 5, en la que dicho tripéptido se selecciona entre los tripéptidos DIR, DLR, EVR,

DPR, TVR, EIR, ELR, INR, LNR, QVR, AVR, GIR, GLR, IVR, LVR, ITR, LTR, DTR, ESR, GGR, DVR, IIR, ILR, LLR, 30 AIR, ALR, ADR, EGR, AGR, DQR, ENR, DMR, EMR, ASR, GTR, IMR, FPR, LMR, IPR y LPR.

7. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho péptido es un dipéptido.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que dicho dipéptido se selecciona entre los dipéptidos IR, LR, PR, DR, 35 VR, SR, AR, ER, MR, NR, QR, y GR.

9. Biblioteca combinatoria de péptidos que consiste en los péptidos de la fórmula

(X1) nX2R

en los que X1 y X2 pueden ser idénticos o diferentes y representan independientemente cualquier aminoácido diferente de arginina; n es 0 ó 1; y

R representa arginina, en los que por lo menos algunos de dichos péptidos muestran una actividad biológica de peptona para inducir el crecimiento celular y/o la densidad celular y/o la viabilidad celular y/o la eficacia de producción de polipéptidos heterólogos en cultivos de huéspedes recombinantes.