Péptidos alfa helicoidales estabilizados y utilizaciones de los mismos.

Polipéptido proapoptósico que contiene hélice α para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedadesneoplásicas,

siendo dicho polipéptido de fórmula (III):

en la que;

cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-10 C20, arilalquilo,cicloalquilalquilo; heteroarilalquilo o heterociclilalquilo;

cada n es independientemente un número entero de 1 a 15;

x es 2, 3 o 6;

cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;

z es un número entero de 1 a 10; y

cada Xaa es independientemente un alfa-aminoácido y es el mismo aminoácido que en el polipéptido proapoptósicoque contiene hélice α.

Péptidos alfa helicoidales estabilizados y utilizaciones de los mismos.

Antecedentes La apoptosis, o muerte celular programada, ejerce un papel crítico en el desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis en todos los organismos pluricelulares. La sensibilidad a la apoptosis varía notablemente entre las células y está influenciada por episodios celulares tanto internos como externos. Se han definido proteínas reguladoras positivas y negativas que actúan como mediadoras del destino celular, y la desregulación de estas redes de señalización de proteínas se ha documentado en la patogenia de un amplio espectro de enfermedades humanas, incluyendo una variedad de cánceres. La BCL-2 es el miembro fundador de esta familia de proteínas apoptósicas y se identificó por primera vez en el punto de ruptura cromosómica de linfomas t (14; 18) (q32; q21) (Bakhashi et al. 1985. Cell 41:899; Clear y et al. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7439) .

La reconfiguración génica coloca a BCL-2 bajo el control de la transcripción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina, generando inadecuadamente altas concentraciones de BCL-2 y la supervivencia celular patológica resultante. Dichas aberraciones en la apoptosis se han identificado en las leucemias linfocítica y mielógena y en muchos otros tumores malignos, y se han relacionado con la evolución tumoral y la resistencia adquirida a la apoptosis provocada por la quimioterapia. La familia BCL-2 de proteínas se ha ampliado considerablemente y comprende tanto moléculas pro- como anti-apoptósicas que proporcionan los controles y equilibrios que rigen la sensibilidad a la muerte celular (FIG. 1) . No es sorprendente que las proteínas apoptósicas se han convertido en objetivos clave para el desarrollo de productos terapéuticos tanto para prevenir la muerte celular precipitada en las enfermedades de pérdida de células como para activar vías de muerte celular en tumores malignos.

La familia BCL-2 está definida por la presencia de hasta cuatro dominios conservados (BH) "homología BCL-2" denominados BH1, BH2, BH3 y BH4, todos los cuales comprenden segmentos a helicoidales (Chittenden et al. 1995 EMBO 14:5589;. Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859) . Las proteínas antiapoptósicas, tales como BCL-2 y BCL-XL, presentan conservación de secuencias en todos los dominios BH. Las proteínas proapoptósicas se dividen en miembros "multidominio" (por ejemplo, BAK, BAX) , que poseen homología en los dominios BH1, BH2 y BH3, y los miembros del "dominio BH3 sólo" (por ejemplo, BID, BAD, BIM, BIK, NOXA, PUMA) , que contienen homología de secuencias exclusivamente en el segmento a-helicoidal anfipático de BH3. Los miembros de la familia BCL-2 tienen capacidad para formar homo- y heterodímeros, lo que sugiere que la unión competitiva y la relación entre las concentraciones de proteínas pro-y antiapoptósicas fijan la sensibilidad a los estímulos de muerte. Las proteínas antiapoptósicas funcionan para proteger a las células del exceso proapoptósico, es decir, de excesiva muerte celular programada. Las medidas de "seguridad" adicionales comprenden la regulación de la transcripción de proteínas proapoptósicas y su mantenimiento como confórmeros inactivos, que requiere la activación proteolítica, desfosforilación o cambio de configuración inducido por el ligando para activar las funciones que favorecen la mortalidad. En determinados tipos de células, las señales de muerte recibidas en la membrana plasmática desencadenan apoptosis por una vía mitocondrial (figura 2) . Las mitocondrias pueden servir como guardián de la muerte celular al secuestrar el citocromo c, un componente crítico de un complejo citosólico que activa la caspasa 9, lo que conduce a actividades proteolíticas mortales aguas abajo. Las proteínas multidominio tales como BCL-2/BCL-XL y BAK/BAX representan papeles de duelo de guardián y verdugo en la membrana mitocondrial, con sus actividades reguladas además por los miembros de sólo BH3 aguas arriba de la familia BCL-2. Por ejemplo, BID es un miembro del subconjunto "sólo dominio BH3" de proteínas proapoptósicas, y transmite las señales de muerte recibidas en la membrana plasmática a las proteínas proapoptósicas efectoras en la membrana mitocondrial. BID tiene la capacidad exclusiva de interactuar tanto con proteínas proapoptósicas como antiapoptósicas y tras la activación por la caspasa 8, desencadena la liberación del citocromo c y la apoptosis mitocondrial. Los estudios de eliminación y mutagenia determinaron que el segmento BH3 a-helicoidal anfipático de miembros proapoptósicos de la familia funciona como un dominio de muerte y por lo tanto representa un motivo estructural fundamental para la interacción con las proteínas multidominio apoptósicas. Estudios estructurales han demostrado que la hélice BH3 interactúa con proteínas antiapoptósicas mediante la inserción en una ranura hidrófoba formada por la interfaz de los dominios BH1, 2 y 3. Las proteínas antiapoptósicas (por ejemplo, BCL-2 y BCL-XL) pueden estar asociadas y ser secuestradas por BID activado y éste puede desencadenar la activación de las proteínas proapoptósicas BAX y BAK, lo que conduce a la liberación de citocromo c y un programa de apoptosis mitocondrial.

BAD es también un miembro de la familia proapoptósica "sólo dominio BH3" cuya expresión igualmente desencadena la activación de BAX/BAK. A diferencia de BID, sin embargo, BAD presenta unión preferente a los miembros antiapoptósicos, BCL-2 y BCL-XL. Mientras que el dominio BH3 de BAD presenta una alta afinidad de unión a BCL-2, péptido BH3 de BAD es incapaz de activar la liberación del citocromo c de las mitocondrias in vitro, lo que sugiere que BAD no es un activador directo de BAX/BAK. Las mitocondrias que sobreexpresan BCL-2 son resistentes a la liberación de citocromo c provocada por BID, pero el tratamiento conjunto con BAD puede restablecer la sensibilidad de BID. La provocación de la apoptosis mitocondrial por BAD parece ser el resultado de:

(1) el desplazamiento de los activadores BAX/BAK, tales como las proteínas BID y similares a BID, del punto de unión de BCL-2/BCL-XL, o (2) la ocupación selectiva del punto de unión de BCL-2/BCL-XL por BAD para evitar el secuestro de proteínas similares a BID por proteínas antiapoptósicas. Por lo tanto, dos clases de proteínas "sólo dominio BH3" han surgido, las proteínas similares a BID que activan directamente la apoptosis mitocondrial y proteínas similares a BAD, que tienen capacidad de sensibilizar las mitocondrias a las proteínas proapoptósicas ocupando los puntos de unión de proteínas de multidominio antiapoptósicas.

El objetivo de la identificación o la generación de pequeñas moléculas para probar las funciones de las proteínas apoptósicas in vitro y manipular específicamente las vías apoptósicas in vivo ha sido un desafío. La detección sistemática de alto rendimiento ha identificado varias moléculas que inhiben la interacción del dominio BH3 de BAK con BCL-XL a afinidades micromolares. Además del potencial inconveniente de la identificación de compuestos de baja afinidad, la técnica está limitada en su capacidad de generar grupos de compuestos adaptados a sutiles especificidades de unión de cada uno de los miembros de las familias de proteínas. Las estrategias alternativas a la manipulación de las vías de apoptosis proceden de la ingeniería de péptidos, técnica que utiliza la secuencia de péptidos no específica para generar compuestos con estructuras tridimensionales deseadas. Una aplicación de esta técnica implicó la generación de hélices a "proapoptósicas" compuestas por la secuencia de péptidos no específica utilizado para provocar la muerte celular hélices por rotura de las membranas mitocondriales.

La hélice alfa es uno de los principales componentes estructurales de las proteínas y a menudo se encuentra en la interfaz de contactos de proteínas, que participan en una amplia variedad de actividades biológicas intermoleculares de reconocimiento. Teóricamente, péptidos helicoidales, tales como la hélice de BH3, podrían utilizarse para interferir selectivamente con las interacciones proteína-proteína o estabilizarlas, y de ese modo manipular procesos fisiológicos. Sin embargo, los motivos helicoidales biológicamente activos dentro de las proteínas suelen tener poca estructura cuando se consideran fuera del contexto de las proteínas completas y se coloca en solución. Por lo tanto, la eficacia de los fragmentos peptídicos de las proteínas como en los reactivos in vivo se ha visto afectada por la pérdida de la estructura secundaria helicoidal, la sensibilidad a la degradación proteolítica y la incapacidad para penetrar en las células intactas. Considerando que se han descrito varias estrategias... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas, siendo dicho polipéptido de fórmula (III) :

en la que;

cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo C1-C20, alquenilo C2-C20, alquinilo C2-C20, arilalquilo, cicloalquilalquilo; heteroarilalquilo o heterociclilalquilo; cada n es independientemente un número entero de 1 a 15;

x es 2, 3 o 6; cada y es independientemente un número entero de 0 a 100; z es un número entero de 1 a 10; y

cada Xaa es independientemente un alfa-aminoácido y es el mismo aminoácido que en el polipéptido proapoptósico que contiene hélice a.

2. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades 25 neoplásicas según la reivindicación 1, en el que - (CH2) n (CH2) n- es alquilo C8 o alquilo C11.

3. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que - (CH2) n (CH2) n- es alquenilo C8 o alquenilo C11.

4. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que R1 y R2 son H o alquilo C1-6.

5. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que polipéptido comprende un dominio BH3. 35

6. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que x es 3 o 6 y z es 1.

7. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades 40 neoplásicas según la reivindicación 1, en el que cada y es independientemente un número entero entre 1 y 15.

8. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo C1-C3.

9. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 8, en el que por lo menos uno de R1 y R2 son metilo.

10. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que x es 3 o 6 y R1 y R2 son metilo. 50

11. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº: 1, o comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la 55 SEC ID nº: 2.

12. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 11, en el que por lo menos uno de R1 o R2 es alquilo C1-6.

13. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que cada R1 y R2 es independientemente H o alquilo C1-C3.

14. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, que comprende además un resto fluorescente, un radioisótopo, un marcador de afinidad, un resto de selección de diana o un resto de biotina.

15. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un polipéptido seleccionado de entre el grupo constituido por los polipéptidos representados en la figura 5.

16. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su utilización en el tratamiento del cáncer. 15

17. Polipéptido proapoptósico que contiene hélice a para su utilización en el tratamiento de cáncer o enfermedades neoplásicas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su utilización en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.