Compuestos orgánicos para la sensibilización de la luminiscencia de lantánidos en dispositivos on-off con aplicaciones bioanalíticas.

Compuestos orgánicos para la sensibilización de la luminiscencia de lantánidos en dispositivos on-off con aplicaciones bioanalíticas.

Esta invención se refiere a compuestos de fórmula I para su aplicación en técnicas bioanalíticas, donde los grupos R1 a R3 están definidos en la descripción.

La presente invención se refiere a ligandos poliheterocíclicos para la formación de complejos con iones metálicos del grupo de los lantánidos para aplicaciones bioanalíticas, Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la detección y/o cuantificación de bioanalitos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los complejos de ciertos iones lantánidos poseen propiedades de emisión de luz muy características que permiten su aplicación en el campo de la detección por luminiscencia. A pesar de que la luminiscencia de sales simples de iones lantánidos, principalmente europio (Eu) , terbio (Tb) , samario (Sm) y disprosio (Dy) , es baja debido, entre otros factores, a su baja absorción en la región UV, las particulares propiedades de emisión de estos iones han sido empleadas profusamente para el estudio de sistemas biológicos. Las aplicaciones de la luminiscencia de los lantánidos van desde el marcaje y/o detección de moléculas de relevancia biológica, a la detección in vivo de funciones celulares y la elucidación de la estructura y función de enzimas y proteínas. Una solución para mejorar la muy baja absorción de la luz excitante es el empleo de un ligando cromóforo orgánico (antena) junto con heteroátomos complejantes. Estos complejos tienen tiempos de vida de emisión muy largos, en el rango de los milisegundos, bandas de emisión muy estrechas y elevados desplazamientos de Stokes. Todas estas características permiten una eliminación muy eficaz de la fluorescencia de fondo lo que aumenta extraordinariamente la sensibilidad de la medida. Los iones lantánidos más empleados son Eu (+3) , Tb (+3) , Sm (+3) y Dy (+3) , Los rendimientos cuánticos de la luminiscencia sensibilizada de estos lantánidos dependen de cuatro parámetros clave:

-la eficiencia con la que se puebla el nivel excitado triplete de la antena, responsable de la sensibilización del ion;

-la energía de este nivel excitado triplete respecto de los niveles emisivos del lantánido (p. ej. 5D) , Este nivel triplete debe estar por encima para una eficaz transferencia de energía ligando ~ ion;

-la distancia que separa el cromóforo del ion. La eficacia de la transferencia de energía sigue una dependencia r6 de la distancia entre ambos;

-el número de moléculas de agua que continúan coordinadas al ion. El oscilador OH desactiva muy eficazmente el estado excitado del lantánido por acoplamiento vibracional.

A pesar de estas características la obtención de cromóforos orgánicos que consigan una buena eficacia en la excitación del complejo, la estabilidad de los complejos adecuada, el máximo rendimiento cuántico y la posibilidad de formar uniones covalente con biomoléculas es un reto difícil.

La versatilidad de las estructuras poli N-heterocíclicas en química de coordinación permite la generación de numerosos complejos con interesantes propiedades catalíticas, fotoquímicas o redox, de las que se derivan un gran número de aplicaciones. Sin embargo el acceso a variaciones estructurales resulta muchas veces complejo, por lo que un gran número de las estructuras descritas se basan en ligandos derivados de la bipiridina o terpiridina que son fácilmente accesibles. Estas estructuras son normalmente simétricas y por ello es difícil afinar la estructura que mejores resultados dé en cuanto a sensibilización de la luminiscencia según la aplicación o el metal empleado.

Existen un gran número de ligandos heterocíclicos desarrollados para la aplicación de sus complejos lantánidos en ensayos bioanalíticos de tipo inmunológico o genético, Por ejemplo la solicitud internacional W02010109065 y las japonesas JP2001335574 y JP2008164554 describen un método de ensayo para oligonucleótidos basado en la luminiscencia de lantánidos generada por reconocimiento de oligonucleótidos complementarios. En concreto, en la W02010109065 los ligandos empleados para la sensibilización de la luminiscencia son derivados piridínicos de distinta naturaleza. En todos los casos en que el anillo de piridina está trisustituido, el anillo de piridina posee como sustituyente común un grupo ácido carboxílico y las estructuras propuestas tienen un acceso sintético lineal lo que plantea limitaciones en cuanto a la posibilidad de modificaciones sintéticas sistemáticas hacia nuevas estructuras con el fin de mejorar las propiedades de sensibilización de los iones lantánidos. Así pues, el método descrito en esta solicitud está limitado a la obtención de productos simétricos.

Por tanto, sería deseable disponer de derivados de piridina trisustituidos con las características mencionadas anteriormente, que sean asimétricos y, por tanto, sería también deseable disponer de un método de síntesis que permita sintetizar dichos compuestos asimétricos, versátil , con sustituyentes fácilmente modificables. Así se podrían diseñar las estructuras de los cromóforos orgánicos según su aplicación.

DESCRIPCION DE LA INVENCiÓN

La presente invención describe derivados poliheterocíclicos basados en anillos de piridina trisustituidos que comprenden en su estructura anillos de pirazol, indazol, imidazol y benzimidazol, caracterizados por ser asimétricos y comprenden en su estructura un grupo isotiocianato (-NCS) para anclarse a una biomolécula y al menos un grupo -COOH para coordinarse a un metal del grupo de los lantánidos. La presente invención también describe el procedimiento de preparación de dichos derivados y su uso como sondas luminiscentes ancladas a biomoléculas tras coordinarse con metales del grupo de los lantánidos.

Por tanto, los compuestos de la presente invención tienen las siguientes ventajas respecto a los compuestos del estado de la técnica:

La disponibilidad de compuestos asimétricos que permite optimizar las técnicas bioanalíticas. Como se ha mencionado anteriormente, los compuestos de la invención son asimétricos, es decir, pertenece al grupo de simetría Cl . Esto quiere decir que la molécula no tiene ningún otro elemento de simetría aparte de un Cl (eje de rotación de 360º C) . Por tanto, gracias a la síntesis de derivados asimétricos, se obtiene gran diversidad de compuestos mediante variaciones sintéticas sencillas. Así la variación sistemática de los tres posibles heterociclos que sustituyen al anillo central de piridina permiten una gran variación de las propiedades de sensibilización de los compuestos hacia los iones lantánidos responsables de la emisión, particularmente, mediante esta invención se han sintetizado derivados asimétricos que hasta ahora no se habían podido obtener.

La posibilidad de unión a biomoléculas a través del grupo -NCS.

La posibilidad de ejercer de ligando antena al coordinarse a través de un 5 grupo -COOH a un metal del grupo de los lantánidos.

Así pues, un aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula 1:

R,

§

N

donde: R1 representa CYao -C:=:C-CYb; R2 representa un grupo de fórmula 11, 111 ó IV:

(NCS) , Re R., . 0\

~

N

Rs /"N /¡ I

N ::::-...

I

N ""-

111 IV;

R3 representa -F, -COOH, -O-CYc o un grupo de fórmula V, VI ó VII:

Rg /"N "I N "" R10 /"N I (NCS) , --0\" /¡ R" ~ N "I N "" ,

N "" -I-

Rll

(NCS) q

R"

V VI VII;

cada Rt, Ra, R9 Y R'3 independientemente representan H o C, -C4 alquilo; cada Rs Y R, o independientemente representan H o -NCS; cada Rs, R7, R'l Y R'2 independientemente representan H, -COOH, -NCS, C, -C4

alquilo o carboxifenilo, donde Cr de fórmula VIII:

C4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo HODe ~

'-N

(-R14

HOOC VIII;

R'4 representa H o C, -C4 alquilo opcionalmente sustituido por un grupo de fórmula IX:

~-N~ ¡=) , NCS

r0

O

IX; cada n, m, p y q independientemente representan O Ó 1; cada CYa, CYb yCYc independientemente representan fenilo o eS-e7 heteroarilo, donde cada CYa y CYb independientemente están opcionalmente sustituidos por uno o más R'5, y donde CYc está opcionalmente sustituido por uno o más R, s; cada R15 independientemente representa -OR17, C1-C4 alquilo o -NCS; cada R16 independientemente representa -NCS º -COOH; y cada R 17 independientemente representa -H o C1-C4 alquilo,

con la condición de que:

i) el compuesto de fórmula I comprenda un grupo -NCS; ii) el compuesto de fórmula I comprenda al menos un grupo -COOH ; y iii) los grupos R2 y R3 son diferentes.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula I tal y como se ha descrito anteriormente...

1. Un compuesto de fórmula 1:

R,

#

N

donde: R1 representa CYao -C=, C-CYb; R2 representa un grupo de fórmula 11, 111 Ó IV:

(NCSl,

--'\

/'"N

) , I

) '---~

N ""

-1

R, (NCSlm 11 111 IV;

R3 representa -F, -COOH, -O-CYc o un grupo de fórmula V, VI ó VII:

ES 2 534 922 Al

(NCS) , R1J

R, -"\-~

N

/" I , /"N /¡ N I ,

RlO \ ,

N ::::-

N ::::-

I

N ::::--

Rll -I

(NCS) q

R"

V VI VII;

cada ~, Ra, Rg Y R13 independientemente representan H o C1-C4 alquilo;

cada Rs Y R10 independientemente representan H o -NCS;

cada R6. R7. R11 Y R12 independientemente representan H, -COOH, -NCS, C1-C4

alquilo o carboxifenilo, donde CC C4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo de fórmula VIII:

Hooe h

'--N

rR'4

HOOC

VIII; R14 representa H o C1-C4 alquilo opcionalmente sustituido por un grupo de fórmula IX: 10

~-N~NCS

~-1

O

IX;

cada n, m, p y q independientemente representan O Ó 1;

cada CYa, CYb y CYc independientemente representan fenilo o CS-C7 heteroarilo, donde 15 cada CYa y CYb independientemente están opcionalmente sustituidos por uno o más R15, y donde CYc está opcionalmente sustituido por uno o más R16; cada R15 independientemente representa -OR17, Cr C4 alquilo o -NCS; cada R16 independientemente representa -NCS o -COOH; y cada R 17 independientemente representa -H o C1-C4 alquilo,

con la condición de que:

ES 2 534 922 Al

i) el compuesto de fórmula I comprenda un grupo -NCS; ii) el compuesto de fórmula I comprenda al menos un grupo -COOH; y ¡ii) los grupos R2 y RJ son diferentes.

.

2. El compuesto según la reivindicación 1, donde R1 representa CYa.

3. El compuesto según la reivindicación 2, donde CYa representa fenilo, tiofenilo o furanilo opcionalmente sustituido por uno o más R'5.

4. El compuesto según la reivindicación 1, donde R1 representa -C::::C-CYb.

5. El compuesto según la reivindicación 4, donde CYb representa fenilo opcionalmente sustituido por uno o más R15.

6. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R2 representa un grupo de fórmula 111 .

7. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde R2 representa un grupo de fórmula IV.

8. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde RJ representa -F.

9. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde RJ represent.

25. COOH.

10. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde RJ representa - O-CYc.

11 . El compuesto según la reivindicación 10, donde CYc representa fenilo opcionalmente sustituido por uno o más R16 .

12. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde RJ representa un grupo de fórmula V.

ES 2 534 922 Al

13. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R3 representa

un grupo de fórmula VI.

14. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R3 representa

S un grupo de fórmula VII.

15. El compuesto según la reivindicación 1, donde:

R, representa CYa;

R2 representa un grupo de fórmula 11 o 111 ;

la R3 representa -F, -COOH o un grupo de fórmula V, VI o VII ;

cada ~, Ra . R9 Y R'3 independientemente representan H o metilo;

cada Rs Y R, o independientemente representan H o -NCS;

cada Rs, R7. R'l Y R'2 independientemente representan H, -COOH, -NCS o metilo;

n representa O;

15 cada p y q independientemente representan 1;

CYa representa fenilo opcionalmente sustituido por un R, s; y

R, s representa -NCS,

con la condición de que·

i) el compuesto de fórmula I comprenda un grupo -NCS;

2 O ii) el compuesto de fórmula I comprenda al menos un grupo -COOH; y

iii) los grupos R2 y RJ son diferentes.

16. El compuesto según la reivindicación 1, donde:

R, representa -C:=:C-CYb;

25 R2 representa un grupo de fórmula 11 o 111 ;

RJ representa -F, -COOH o un grupo de fórmula V, VI o VII;

cada ~, Ra , R9 Y R'J independientemente representan H o metilo;

cada Rs Y R, o independientemente representan H o -NCS;

cada Rs, R7 , R" Y R'2 independientemente representan H, -COOH, -NCS o metilo;

3 O n representa O;

cada p y q independientemente representan 1;

CYb representa fenilo opcionalmente sustituido por un R, s; y

R, s representa -NCS,

con la condición de que:

35 i) el compuesto de fórmula I comprenda un grupo -NCS;

ES 2 534922 Al

ii) el compuesto de fórmula I comprenda al menos un grupo -COOH; y iii) los grupos R2 y ~son diferentes.

17. El compuesto según la reivindicación 1, seleccionado de:

NCS NCS NCS

1'" 1'"

~~

""1 ""1

F ~ N F ~ N

~~ ~9

~N-~ N"'{ N

COOH· COOH· COOH · NCS

NCS

'"

~ "'1

F

~N N, ~

N

'" '"

HOOC ~

N '-N SCN- (~ N

-N ~N-9 -N ~~N

~~ ~

>

COOH· HOOC COOH ;

'"

'"

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'"

'"

~

~

SCNQ~ N N

cjN

-N ~N-~ SeN r¡_ -N ~N-~ COOH · COOH

'"

~

'"

O N ~

~~ SCN--.f'~ N~ ~n COOH

S~COOH N-~N~

N

SCN COOH ;

SCNQ~

-N

NCS

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h'

1'"

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N

-N

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SCN--- (~

-N

SCN--- (~

-N

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h'

'"

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N N--N

~9 ~~

COOH

NCS

"" 1

F ~N N, ~ F

HOOC '-N

~9 N-)

NCOOH HOOC

'"

h'

1'"

N /. ~: ( SCN--- (~

N--N

COOH ·

'" O

1'"

N /. ~: ( SCN--- (~

N--N

COOH ·

NCS

1'"

h'

1'"

N /. (~

N

COOH · NCS

1'"

h'

~I~N ~r~ ¡,

N

HOOC

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h'

\ \

1'"

/.

N

'-N

)

HOOC

~9

N

COOH ;

'" O

1'" ~9

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N

N

COOH ·

ES 2 534 922 Al

'" s '"

F ~N %')

HOOC )

'" S

'-N

HOOC~ 1 ""

NH SCN....J'~ N /. ~'"\

~N

N~

Oi-Q-NCS.

COOH '

o ~

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SCNn~

SCN....J'~

N /. ~'"\

~N

~N N~

COOH '

O~ 11

"'1

/. ~ N ~ '"\

N %: ( SCN-{ ) J N", <

COOH; y COOH.

s 18. Procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula I tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que comprende: a) Hacer reaccionar un compuesto de fórmula X o un compuesto de formula XI con R, B (OH) ,

x XI

donde R1 es CYa y donde R2 y R3 tienen el significado descrito para un compuesto de fórmula 1; o ES 2 534 922 Al

b) Hacer reaccionar un compuesto de fórmula X o un compuesto de formula XI con Rr H

x XI

donde R1 -C=C-CYb y donde R2 y R3 tienen el significado descrito para un compuesto S de fórmula 1; o e) hacer reaccionar un compuesto de fórmula XII con un compuesto de fórmula R2M

R,

FÓ

N/. F

XII

donde M representa un metal alcalino y donde R1 y R2 tienen el significado descrito para un compuesto de fórmula 1; o 10 d) transformar, en una o más etapas, un compuesto de fórmula I en otro compuesto de fámula l.

19. Kit que comprende un compuesto de fórmula I tal y como se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un compuesto de un ión lantánido (+3) 15 (representado por Ln) seleccionado de europio, terbio, samario, disprosio, praseodimio, neodimio, holmio, erbio, tulio e iterbio, donde el compuesto del ión lantánido (+3) es una sal seleccionada de LnCb, LnN03 y Ln (CF3 S03h. o un complejo seleccionado de complejos de iones lantánido con ligandos poliaminocarboxílicos seleccionados de EDTA (ácido 2, 2', 2", 2"'- (etano-1 , 2-diildinitrilo) tetraacético, DTPA

O (ácido 2, 2', 2", 2"', 2""- (etano-1 , 2-diilnitrilo) pentaacético ) , DOTA (ácido 1, 4, 7, 10tetraazaciclododecano-1, 4, 7, 1 O-tetraacético) , NOTA (ácido 1, 4, 7-triazonano-1, 4, 7triacético) , TETA (ácido 2, 2', 2", 2"'- (1, 4, 8, 11-tetraazaciclotetradecano-1 , 4, 8, 11tetrailo) tetraacético) y DETA (ácido 1, 4, 7 -triazaciclodecano-1 , 4, 7 -triacético) .

20. Uso del kit tal y como se ha definido en la reivindicación 19 para ensayos bioanalíticos, donde la biomolécula se selecciona de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, derivados de ácidos nucleicos, nucleótidos y hormonas.