Un oligonucleótido antisentido que se une al gen de distrofina humana induciendo la omisión de exón en el gen de distrofina,

consistente en la secuencia de SEQ ID NO 181, opcionalmente en el que las bases de uracilo (U) son bases de timina (T)

Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y composiciones antisentido novedosos adecuados para facilitar la omisión de exón. Proporciona también métodos para inducir la omisión de exón usando los compuestos antisentido novedosos así como composiciones terapéuticas adaptadas para uso en los métodos de la invención.

Antecedentes de la técnica

Se está dedicando un esfuerzo significativo actualmente a la búsqueda de métodos para suprimir o compensar mutaciones causantes de enfermedades en genes. Las tecnologías antisentido se están desarrollando usando una serie de químicas para afectar a la expresión génica a una variedad de niveles diferentes (transcripción, corte y empalme, estabilidad y traducción). Mucha de esa investigación se ha centrado en el uso de compuestos antisentido para corregir o compensar genes anormales o asociados a enfermedades en una pluralidad de afecciones diferentes.

Las moléculas antisentido son capaces de inhibir la expresión génica con suma especificidad y, debido a esto, muchos esfuerzos de investigación referentes a los oligonucleótidos como moduladores de la expresión génica se han centrado en inhibir la expresión de genes diana tales como oncogenes o genes víricos. Los oligonucleótidos antisentido están orientados hacia ARN (hebra codificante) o hacia ADN, donde forman estructuras triples que inhiben la transcripción por ARN polimerasa II. Para conseguir el efecto deseado en una regulación génica negativa específica, los oligonucleótidos deben promover la descomposición del ARNm diana o bloquear la traducción de ese ARNm, evitando así eficazmente la síntesis de novo de la proteína diana indeseable.

Dichas técnicas no son útiles cuando el objetivo es regular positivamente la producción de proteína nativa o compensar mutaciones que inducen la terminación prematura de la traducción, tales como mutaciones finalizadoras o de desplazamiento de marco.

Además, en casos en que una proteína normalmente funcional se termina prematuramente debido a las mutaciones en la misma, se ha mostrado que es posible un medio para restaurar cierta producción de proteína funcional por la tecnología antisentido mediante la intervención durante los procesos de corte y empalme (Sierakowska H, et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12840-12844; Wilton SD, et al., (1999) Neuromusc. Disorders 9, 330-338; van Deutekom JC et al., (2001) Human Mol. Genet. 10, 1547-1554). En estos casos, el transcrito génico defectivo no debe someterse a degradación dirigida, de modo que la química del oligonucleótido antisentido no promueva la descomposición del ARNm diana.

En una variedad de enfermedades genéticas, pueden modularse los efectos de las mutaciones sobre la expresión eventual de un gen mediante un proceso de omisión de exón dirigida durante el proceso de corte y empalme. El proceso de corte y empalme está regido por una maquinaria multipartícula compleja que pone en estrecha proximidad las conexiones exón-intrón adyacentes en el pre-ARNm y efectúa la escisión de los enlaces fosfodiéster en los extremos de los intrones, con su posterior reformación entre exones que se van a cortar y empalmar conjuntamente. Este proceso complejo y altamente preciso está mediado por motivos de secuencia en el pre-ARNm que son segmentos de ARN semiconservados relativamente cortos a los que se unen los diversos factores de corte y empalme nucleares que están entonces implicados en las reacciones de corte y empalme. Al cambiar el modo en que la maquinaria de corte y empalme lee o reconoce los motivos implicados en el procesamiento de pre-ARNm, es posible crear moléculas de ARNm cortadas y empalmadas diferencialmente. Se ha reconocido ahora que la mayoría de los genes humanos se cortan y empalman de forma alternativa durante la expresión génica normal, aunque no se han identificado los mecanismos implicados. Usando oligonucleótidos antisentido, se ha mostrado que los errores y deficiencias en un ARNm codificado podrían evitarse o eliminarse de los transcritos génicos maduros.

En la naturaleza, la extensión de la deleción genética u omisión de exón en el proceso de corte y empalme no se entiende completamente, aunque se ha documentado que ocurre en muchos casos, generalmente a niveles muy bajos (Sherrat TG, et al., (1993) Am. J. Hum. Genet. 53, 1007-1015). Sin embargo, se ha reconocido que si pueden eliminarse específicamente de algunos genes los exones asociados a mutaciones causantes de enfermedades, puede producirse a veces un producto proteico acortado que tiene propiedades biológicas similares a la proteína nativa o que tiene suficiente actividad biológica para mejorar la enfermedad causada por mutaciones asociadas al exón diana (Lu QL, et al., (2003) Nature Medicine 9, 1009-1014; Aartsma-Rus A et al., (2004) Am. J. Hum. Genet. 74: 83-92).

Este proceso de omisión de exón dirigida es probable que sea particularmente útil en genes largos cuando hay muchos exones e intrones, cuando hay redundancia en la constitución genética de los exones o cuando una proteína es capaz de funcionar sin uno o más exones particulares (por ejemplo, con el gen de distrofina, que consiste en 79 exones, o posiblemente algunos genes de colágeno que codifican bloques repetidos de secuencia o los enormes genes de nebulina o titina que comprenden ∼80 y más de 370 exones, respectivamente).

Los esfuerzos para reorientar el procesamiento génico para el tratamiento enfermedades genéticas asociadas a truncamientos causados por mutaciones en diversos genes se han centrado en el uso de oligonucleótidos antisentido que: (1) se superponen total o parcialmente con los elementos implicados en el proceso de corte y empalme, o (2) se unen al pre-ARNm en una posición suficientemente cercana al elemento para desestabilizar la unión y función de los factores de corte y empalme que mediarían normalmente una reacción de corte y empalme particular que ocurre en ese elemento (por ejemplo, se unen a pre-ARNm en una posición a 3, 6 o 9 nucleótidos del elemento a bloquear).

Por ejemplo, se ha notificado la modulación del corte y empalme de pre-ARNm de distrofina mutante con oligorribonucleótidos antisentido tanto in vitro como in vivo. En un tipo de mutación de distrofina notificado en Japón, una mutación de deleción de 52 pares de bases causa que el exón 19 se elimine con los intrones flanqueantes durante el proceso de corte y empalme (Matsuo et al., (1991) J. Clin. Invest. 87: 2127-2131). Se ha usado un sistema de corte y empalme de minigén in vitro para mostrar que un 2'-O-metiloligorribonucleótido de 31 unidades complementario de la mitad 5' de la secuencia eliminada en el exón 19 Kobe de distrofina inhibía el corte y empalme de pre-ARNm de tipo silvestre (Takeshima et al. (1995), J. Clin. Invest. 95, 515-520). Se usó el mismo oligonucleótido para inducir la omisión de exón del transcrito génico de distrofina nativa en células linfoblastoides cultivadas humanas.

Dunckley et al., (1997) Nucleosides & Nucleotides, 16, 1665-1668 describieron constructos in vitro para el análisis del corte y empalme alrededor del exón 23 de distrofina mutada en el mutante mdx de ratón, un modelo de distrofia muscular. Se debatían planes para analizar estos constructos in vitro usando oligonucleótidos 2'-modificados dirigidos a sitios de corte y empalme en y adyacentes al exón 23 de distrofina de ratón, pero no se daban sitios ni secuencias diana.

Se notificó posteriormente que los 2'-O-metiloligorribonucleótidos corregían la deficiencia de distrofina en mioblastos de ratón mdx de este grupo. Se notificó que un oligonucleótido antisentido dirigido al sitio de corte y empalme 3' del intrón 22 de distrofina de múrido causaba la omisión del exón mutante, así como de varios exones flanqueantes, y creaba un transcrito de distrofina en fase novedoso con una deleción interna novedosa. Esta distrofina mutada se expresaba en el 1-2% de los miotubos mdx tratados con antisentido. Se describe el uso de otras modificaciones oligonucleotídicas tales como 2'-O-metoxietilfosfodiésteres (Dunckley et al. (1998) Human Mol. Genetics, 5, 1083-90).

Por tanto, las moléculas antisentido pueden proporcionar una herramienta en... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido antisentido que se une al gen de distrofina humana induciendo la omisión de exón en el gen de distrofina, consistente en la secuencia de SEQ ID NO 181, opcionalmente en el que las bases de uracilo (U) son bases de timina (T).

2. Un oligonucleótido antisentido aislado de hasta 50 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido antisentido comprende el oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1.

3. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido antisentido comprende una cadena principal modificada o ligamientos internucleotídicos no naturales.

4. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido antisentido se liga químicamente con uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido antisentido.

5. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido antisentido no activa la ARNasa H.

6. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3, en el que los restos de azúcar de la cadena principal oligonucleotídica se reemplazan por restos no naturales.

7. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 3, en el que la cadena principal modificada comprende morfolinos.

8. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que los ligamientos internucleotídicos de la cadena principal oligonucleotídica se reemplazan por ligamientos internucleotídicos no naturales.

9. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 8, en el que los ligamientos internucleotídicos no naturales son fosfatos modificados.

10. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 9, en el que los fosfatos modificados se seleccionan de metilfosfonatos, metilfosforotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos y fosforoamidatos.

11. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 10, en el que los fosfatos modificados se seleccionan de fosforoamidatos.

12. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 10, en el que los fosfatos modificados se seleccionan de fosforomorfolidatos.

13. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 10, en el que los fosfatos modificados se seleccionan de fosforopiperazidatos.

14. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que los restos de azúcar de la cadena principal oligonucleotídica se reemplazan por restos no naturales y los ligamientos internucleotídicos de la cadena principal oligonucleotídica se reemplazan por ligamientos internucleotídicos no naturales.

15. El oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que las bases de uracilo son bases de timina.

16. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 15, en el que el oligonucleótido antisentido se liga químicamente con uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido antisentido.

17. El oligonucleótido antisentido de la reivindicación 16, en el que el oligonucleótido antisentido se liga químicamente con una cadena de polietilenglicol.

18. Una composición que comprende un oligonucleótido antisentido según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

19. Un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o una composición según la reivindicación 18, para uso en un método de tratamiento de distrofia muscular en un paciente.