Obtención de un virus de la gripe.

Un método para producir una partícula replicable de un virus de la gripe sin el uso de virus auxiliar,

quecomprende cultivar una célula transfectada con 7 u 8 ácidos nucleicos, en donde dichos ácidos nucleicoscomprenden respectivamente un segmento génico del virus de la gripe y un promotor de polimerasa debacteriófago o los ácidos nucleicos comprenden respectivamente el complemento de un segmento génico delvirus de la gripe y un promotor de polimerasa de bacteriófago, y en donde la célula está provistaadicionalmente de una polimerasa de bacteriófago.

Obtención de un virus de la gripe La invención se refiere al campo de la producción de vacunas contra el virus de la gripe.

Los virus de la gripe (Orthomyxoviridae) son virus de RNA de cadena negativa con envolvente con un genoma segmentado (Taubenberger and Layne, Molecular Diagnosis Vol. 6 No. 4 2001) . Se dividen en dos géneros: uno que incluye los virus de la gripe A y B y el otro que consiste en el virus de la gripe C, basados en diferencias antigénicas significativas entre sus nucleoproteínas y proteínas de la matriz. Los tres tipos de virus difieren también en patogenicidad y organización genómica. El tipo A se encuentra en una amplia gama de animales de sangre caliente, pero los tipos B y C son predominantemente patógenos humanos. Los virus de la gripe A se subdividen además por caracterización antigénica de las glicoproteínas de superficie hemaglutinina (HA) y NA que sobresalen de la superficie del virión. Hay usualmente 15 subtipos de HA y nueve de NA. Los virus de la gripe A infectan una amplia variedad de animales, incluyendo aves, cerdos, caballos, seres humanos y otros mamíferos. Las aves acuáticas sirven como reservorio natural para todos los subtipos conocidos de virus de la gripe A y probablemente son la fuente de material genético para las cepas de la gripe pandémica humana.

A diferencia de los paramixovirus relacionados, los virus de la gripe tienen un genoma de RNA segmentado. Los virus de la gripe A y B tienen una estructura similar, mientras que la del virus de la gripe C es más divergente. Así como los virus de los tipos A y B contiene cada uno ocho segmentos génicos diferenciados que codifican cada uno al menos una proteína, el del tipo C contiene siete segmentos diferenciados, combinando los segmentos 4 y 6 de los tipos A y B. Los virus de la gripe A y B están recubiertos con tres proteínas que sobresalen: HA, NA y de la matriz 2 (M2) . Los virus de la gripe C tienen solamente una glicoproteína de superficie. Cada segmento de RNA del virus de la gripe está encapsidado por nucleoproteínas (NP) formando complejos ribonucleótido-nucleoproteína (RNP) . Las tres proteínas polimerasas están asociadas a un extremo del complejo RNP. Los RNP están rodeados por una membrana con la proteína de la matriz (matriz 1) como parte integral. La porción de fosfolípido de la envolvente procede de la membrana de la célula hospedante. También dentro de la partícula viral se encuentra la proteína no estructural 2 (NS2) .

Las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la nomenclatura de los virus de la gripe son las siguientes. Primero, se designa el tipo de virus (A, B o C) , luego el hospedante (si no es humano) , el lugar de aislamiento, el número de aislamiento y el año de aislamiento (separados por barras inclinadas) . Para la gripe A, los subtipos HA y NA se anotan entre paréntesis. Por ejemplo, las cepas incluidas en la reciente vacuna trivalente para la temporada 2000 a 2001 son: A/Panamá/2007/99 (H3N2) , A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) y B/Yamanashi /16/98. Desde 1977, ha habido dos subtipos de gripe A circulando conjuntamente en los seres humanos: H1N1 y H3N2.

Los virus de la gripe acumulan mutaciones puntuales durante su replicación debido a que su complejo RNApolimerasa no tiene actividad de corrección. Las mutaciones que cambian aminoácidos en las porciones antigénicas 35 de las glicoproteínas de superficie pueden aportar ventajas selectivas para una cepa viral permitiéndole eludir la inmunidad preexistente. La molécula de HA inicia la infección uniéndose a los receptores en ciertas células hospedantes. Los anticuerpos contra la proteína HA impiden la unión al receptor y son muy eficaces en prevenir la reinfección con la misma cepa. La HA puede eludir la inmunidad previamente adquirida por su deriva antigénica, en la cual las mutaciones del gen HA actualmente circulante evita la unión al anticuerpo, o deriva antigénica, en la cual el virus adquiere HA de un nuevo subtipo. Las presiones de la deriva antigénica no son iguales a través de la molécula de HA, ocurriendo cambios positivamente seleccionados predominantemente en la cabeza globular de la proteína HA. Estos cambios se acumulan también en una mayor extensión en HA que en NA. Los cambios en otras proteínas de un virus de la gripe pueden ocurrir más lentamente. Análogamente, la presión de la deriva antigénica es mayor en las cepas de virus de la gripe adaptadas a los seres humanos, intermedia en las cepas adaptadas a 45 cerdos y equinos, y menor en las cepas adaptadas a las aves.

Debido a que los virus de la gripe tienen un genoma segmentado, la co-infección con dos cepas diferentes en el mismo hospedante puede conducir a la producción de nuevas cepas del virus de la gripe reorganizadas que contengan diferentes combinaciones de segmentos de los genes parentales. Se sabe de la existencia de quince subtipos de HA en aves silvestres que proporcionan una fuente de diversas HA nuevas para los seres humanos. La aparición en la circulación humana de una cepa del virus de la gripe con un nuevo subtipo por la deriva antigénica ha sido la causa de las dos últimas pandemias de gripe en 1957 y 1968 y muy probablemente fue la causa de la pandemia de gripe de 1918. Para estar en concordancia con todo lo que se sabe de los virus pandémicos de la gripe, una cepa pandémica debe tener una HA antigénicamente distinta de la que predomina usualmente; esta HA no puede haber circulado en los seres humanos durante 60 a 70 años; y el virus debe ser transmisible entre seres 55 humanos. Tanto en 1957 como en 1968, las pandemias resultaron de una deriva en la HA, y en ambos casos, las HA de las cepas pandémicas estaban estrechamente relacionadas con las cepas aviares. Aunque uno de los requisitos absolutos para una pandemia sea que la HA debe cambiar, se desconoce la extensión en la cual puede o debe cambiar el resto del virus. Solamente los virus pandémicos de 1957 y 1968 están disponibles para el estudio directo, mientras que el virus de la gripe pandémica de 1918 está siendo caracterizado usando arqueología molecular. En 1957, tres genes fueron reemplazados por genes similares de aves: el HA, el NA, y una subunidad del

complejo de polimerasa (PB1) . En 1968, solamente fueron reemplazados el HA y PB1.

Un diagnóstico específico de infección por gripe se puede hacer por aislamiento del virus, ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) , detección de antígenos por inmunoensayos, ensayos serológicos, demonstración de actividad de NA en secreciones, o ensayos basados en moléculas. Las muestras pueden ser recogidas en forma de esputos, exudado nasofaríngeo o lavado nasofaríngeo obtenido por gárgaras con una solución salina tamponada. El patrón para la diagnosis de la gripe ha sido la caracterización inmunológica después del cultivo. El análisis serológico proporciona un método seguro pero retrospectivo para la infección por gripe debido a que requiere la recogida de sueros tanto de pacientes graves como convalecientes.

Los virus de la gripe pueden ser cultivados en huevos de gallina embrionados o en cierto número de sistemas de cultivo de tejidos. La adición de tripsina (para la activación de la escisión de HA) permite la propagación de un virus de la gripe en células de riñón canino Madin-Darby (abreviadamente en lo sucesivo MDCK por la expresión inglesa Madin-Darby Canine Kidney) y otras líneas. El método principal para la producción de vacunas es todavía el cultivo de virus de la gripe en huevos. El cultivo en líneas celulares se usa comúnmente para el aislamiento primario de los virus de la gripe humana (tanto de tipo A como B) . Muchos virus de la gripe humana se pueden cultivar directamente en la cavidad alantoidea de huevos embrionados. Algunos virus de la gripe A y B requieren el cultivo inicial en la cavidad amniótica y la subsiguiente adaptación a la cavidad alantoidea. Después del aislamiento del cultivo, la mayoría de los aislados de la gripe se identifican definitivamente usando inmunoensayos o inmunofluorescencia. Las moléculas de HA de los virus de la gripe se unen a residuos de ácido siálico en la superficie de las células respiratorias para que el virus consiga la entrada.

Las cepas del virus de la gripe pueden ser caracterizadas antigénicamente aprovechando la capacidad de los virus de la gripe de aglutinar eritrocitos in vitro. Los anticuerpos anti-HA pueden inhibir la aglutinación. Por tanto, un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI) es uno de los métodos estándares usado para caracterizar cepas del virus de la gripe. Los ensayos de Hl se usan para determinar si las cepas de muestra están relacionadas inmunológicamente (es decir, presentan reacción cruzada) con cepas de vacunas recientes. Sueros de tipificación,... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una partícula replicable de un virus de la gripe sin el uso de virus auxiliar, que comprende cultivar una célula transfectada con 7 u 8 ácidos nucleicos, en donde dichos ácidos nucleicos comprenden respectivamente un segmento génico del virus de la gripe y un promotor de polimerasa de bacteriófago o los ácidos nucleicos comprenden respectivamente el complemento de un segmento génico del virus de la gripe y un promotor de polimerasa de bacteriófago, y en donde la célula está provista adicionalmente de una polimerasa de bacteriófago.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los ácidos nucleicos usados en dicho método no comprenden un terminador de polimerasa de bacteriófago.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde los ácidos nucleicos usados en dicho método han sido provistos con al menos un residuo de guanina adicional próximo al promotor de la polimerasa de bacteriófago.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los ácidos nucleicos usados en dicho método han sido provistos con dos residuos de guanina adicionales próximos al promotor de la polimerasa de bacteriófago.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho promotor de la polimerasa de bacteriófago es el promotor de la polimerasa de T7.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la transfección de la célula es con doce, plásmidos unidireccionales que expresan ocho ácidos nucleicos vRNA del virus de la gripe, así como la nucleoproteína del virus de la gripe y las proteínas polimerasas PA, PB1 y PB2.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde al menos un ácido nucleico usado en dicho método comprende un segmento génico de virus de la gripe procede de un virus de la gripe recomendado por la Organización Mundial de la Salud para fines vacunales. .

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde al menos un ácido nucleico usado en dicho método comprende un segmento génico del virus de la gripe A.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicha polimerasa de bacteriófago comprende una señal de localización nuclear.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha polimerasa de bacteriófago es polimerasa de T7.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la célula usada en el método es una célula que no es de primate.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula usada en el método es una célula de MDCK o una célula CEF.

13. Una preparación celular transfectada con los ácidos nucleicos de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Una composición que comprende una preparación celular de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 14, para la producción de una composición farmacéutica dirigida a generar protección inmunológica contra la infección de un sujeto por un virus de la gripe.

16. Composición de acuerdo con la reivindicación 14, para uso en la generación de protección inmunológica contra la infección de un sujeto por un virus de la gripe.

17. Un ácido nucleico que comprende un segmento génico de un virus de la gripe y un promotor de polimerasa del bacteriófago T7, en donde dicho ácido nucleico ha sido provisto con al menos un residuo de guanina adicional próximo a dicho promotor, o un ácido nucleico que comprende el complemento de un segmento génico de un virus de la gripe y un promotor de polimerasa del bacteriófago T7, en donde dicho ácido nucleico ha sido provisto con al menos un residuo de guanina adicional próximo a dicho promotor.

18. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 17, que ha sido provisto con dos residuos de guanina adicionales próximos al promotor.

19. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18, que comprende un segmento génico que procede de un virus de la gripe virus recomendado por la OMS para fines vacunales.

20. El ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que comprende un segmento génico del virus de la gripe A.

21. Una célula provista de al menos un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a

20.

22. La célula de acuerdo con la reivindicación 21, que está provista adicionalmente de una polimerasa del bacteriófago T7.

23. La célula de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha polimerasa comprende una señal de localización nuclear.

24. Una célula que no es de primate de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23. 10 25. La célula de acuerdo con la reivindicación 24, que es una célula de MDCK o una célula CEF.

26. La célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, que no ha sido provista de un virus auxiliar.

27. Uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 13, para la producción de una composición farmacéutica dirigida a generar protección inmunológica contra la infección de un sujeto por un virus de la gripe.

28. Uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 21, para la producción de una composición farmacéutica dirigida a generar protección inmunológica contra la infección de un sujeto por un virus de la gripe.