Nuevos procedimientos.

Un procedimiento para la expresión de un polipéptido en una célula huésped recombinante de mamífero que comprende cultivar la célula huésped en condiciones apropiadas,

en el que dicha célula huésped comprende un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido GB1 unido directa o indirectamente a un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, y purificar tal polipéptido, en el que dicho polinucleótido GB1 codifica una secuencia seleccionada de la SEC ID Nº: 1, 2 ó 3 o una secuencia con al menos una identidad del 90% con una secuencia seleccionada de la SEC ID Nº: 1, 2 ó 3.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/019872.

Solicitante: GLAXOSMITHKLINE LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: One Franklin Plaza P.O. Box 7929 Philadelphia, PA 19101 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: JOHANSON,Kyung Oh, TRILL,John J.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).
  • C12P21/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).

PDF original: ES-2379096_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Nuevos procedimientos Campo de la invención La presente invención se refiere al uso del dominio B1 de la Proteína G como un marcador de epítope para la sobreexpresión de proteínas en células de mamíferos.

Antecedentes de la invención El dominio B1 de unión a inmunoglobulina de la proteína G estreptocócica (en el presente documento denominado algunas veces GB1) , como se ilustra en Park, y col. Biochemistr y , 36:14277-14283 (1997) , es una proteína pequeña con un núcleo hidrófobo bien desarrollado, que se pliega en una lámina beta de 4 cadenas con una hélice alfa flanqueante. Esta proteína no contiene disulfuros o cisteinas libres, ni prolinas o motivos de unión a metales. La GB1 es muy estable y soluble y es uno de los sistemas de modelos más ampliamente usados en el área del plegamiento y diseño de proteínas.

Además, la GB1 contiene en su superficie sitios de unión para el fragmento C-terminal de la cadena pesada de la inmunoglobulina G (IgGFc) . Las proteínas que contienen este dominio pueden purificarse por Fc inmovilizado, eluirse de la columna de afinidad mediante ácidos o cortarse proteolíticamente y detectarse mediante reactivos existentes.

Hammarstrom, y col. Protein Sci., 11:313-321 (2002) han descrito, comparando niveles de expresión de fusiones de proteínas de expresión solubles con este dominio B1 con fusiones usando MBP, NusA, ZZ, GST, Tioredoxina y 6His y 26 proteínas diferentes, que GB1 proporciona un mayor porcentaje de proteínas solubles expresadas en E. coli. Zhou, y col. Journal of Biomolecular NMR, 20:11-14 (2001) también han descrito que cuando este dominio se usa como un marcador de epítope para la fusión con proteínas recombinantes expresadas en E. coli, no es necesario eliminarlo para obtener la estructura RMN. Finalmente, Cheng & Patel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:401405 (2004) llegaron a la conclusión de que la expresión de proteínas que contenían GB1 en E. coli aumentaban los niveles de expresión.

En una mayoría de casos, debido a problemas en cuanto al plegamiento y a la solubilidad de las proteínas, muchas proteínas recombinantes no pueden expresarse en organismos procariotas. Por lo tanto, las células de mamífero son el sistema de expresión de elección para proteínas recombinantes que requieren amplias modificaciones posttraduccionales. Sin embargo, incluso con sistemas de expresión de mamíferos, la baja expresión y la baja actividad de las proteínas recombinantes expresadas usando marcadores de epítope pequeños, tales como 6 Histidinas y marcador Strep-II, han influido negativamente en la purificación a gran escala por cristalografía y HTS. Datos obtenidos a partir de la expresión de la lipasa endotelial indican que sin marcador, con un marcador de 6 Histidinas o con 6 Histidinas/Strep-II, la expresión era muy baja a niveles > 1 mg/litro.

Se ha demostrado que el uso de la región IgGFc como un marcador conduce a niveles muy altos de expresión de proteínas. Sin embargo, este marcador puede perjudicar a genes que requieren una orientación particular tal como un dímero inverso. Bloquean el plegamiento correcto y, de esta manera, conducen a una pérdida de actividad.

Por tanto, aún existe una necesidad para la expresión o sobreexpresión de polipéptidos seleccionados en células de mamífero. Fue totalmente inesperado descubrir, en la presente invención, un drástico aumento en los niveles de expresión en células de mamífero usando un marcador de GB1 sobre los marcadores usados tradicionalmente y observar una actividad completa en todas las proteínas examinadas.

Sumario de la invención En un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la expresión de un polipéptido (de interés) en una célula huésped recombinante de mamífero que comprende cultivar la célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido GB1 directa o indirectamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido de interés que produce el polipéptido en una condición de cultivo apropiada y purificar dicho polipéptido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos fabricados por el procedimiento anterior.

Para la producción del polipéptido, también se describe un vector de expresión para usar en una célula huésped recombinante de mamífero, que comprende al menos un polinucleótido GB1 directa o indirectamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido.

Sin embargo en otro aspecto, para la producción del polipéptido, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante de mamífero que comprende un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido GB1 directa o indirectamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido.

Descripción detallada Como se usa en el presente documento "polipéptidos GB1" incluyen polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que posee al menos una identidad del 70%, al menos una identidad del 80%, al menos una identidad del 90%, al menos un identidad del 95%, al menos una identidad del 97-99%, con la de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3, respectivamente. Dichos polipéptidos incluyen los que comprenden los aminoácidos de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3.

DTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (SEC ID Nº : 1)

MDTYKLILINGKTLKGETTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (SEC ID Nº : 2)

MEILAALPKTDTYKLILINGKTLKGETTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (SEC ID Nº : 3)

Adicionalmente, los polipéptidos GB1 incluyen polipéptidos aislados, en los que la secuencia de aminoácidos poseen al menos una identidad del 70%, al menos una identidad del 80%, al menos una identidad del 90%, al menos una identidad del 95%, al menos una identidad del 97-99%, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3, respectivamente. Tales polipéptidos incluyen el polipéptido de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3.

Adicionalmente, los polipéptidos GB1 incluyen polipéptidos aislados codificados por un polinucleótido que comprende la secuencia contenida en la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6.

Como se usa en el presente documento "polipéptidos BG1" incluyen polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que posee al menos una identidad del 70%, al menos una identidad del 80%, al menos una identidad del 90%, al menos una identidad del 95%, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3, sobre la longitud completa de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3, respectivamente. En este sentido, también se incluyen los polipéptidos que poseen al menos una identidad del 97%, al menos una identidad del 98-99% y al menos una identidad del 99%. Tales polinucleótidos incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6, que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3, respectivamente o un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos contenida en la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6 que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3, respectivamente.

Adicionalmente, los polinucleótidos de la presente invención incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que posee al menos una identidad del 70%, al menos una identidad del 80%, al menos una identidad del 90%, al menos una identidad del 95%, con la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6 sobre la longitud completa de la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6, respectivamente. En este sentido, también se incluyen los polinucleótidos que poseen al menos una identidad del 97%, al menos una identidad del 98-99% y al menos una identidad del 99%. Tales polinucleótidos incluyen un polinucleótido que comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6 así como el polinucleótido de la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6.

La invención también proporciona polinucleótidos que son complementarios con todos los polinucleótidos descritos anteriormente:

gacat tacaaattaa tccttaatgg taaaacattg aaaggcgaaa caactactga agctgttgat

gctgctactg cagaaaaagt cttcaaacaa tacgctaacg acaacggtgt tgacggtgaa tggacttacg acgatgcgac taagaccttt acagttactg aa (SEC ID Nº : 4)

atggacact tacaaattaa tccttaatgg taaaacattg aaaggcgaaa caactactga agctgttgat

gctgctactg cagaaaaagt cttcaaacaa tacgctaacg acaacggtgt tgacggtgaa tggacttacg acgatgcgac taagaccttt... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la expresión de un polipéptido en una célula huésped recombinante de mamífero que comprende cultivar la célula huésped en condiciones apropiadas, en el que dicha célula huésped comprende un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido GB1 unido directa o indirectamente a un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, y purificar tal polipéptido, en el que dicho polinucleótido GB1 codifica una secuencia seleccionada de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3 o una secuencia con al menos una identidad del 90% con una secuencia seleccionada de la SEC ID Nº : 1, 2 ó 3.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un polinucleótido GB1 es la SEC ID Nº : 4, 5 ó 6.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dichas células huéspedes son células de Ovario de Hámster 10 Chino.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dichas células huéspedes son células de Ovario de Hámster Chino que contienen el gen E1A de adenovirus.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dichas células huéspedes son células COS o HEK.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho al menos un polinucleótido

GB1 está unido directamente o indirectamente al extremo carboxi terminal del polinucleótido que codifica dicho polipéptido.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho al menos un polinucleótido GB1 está unido mediante un sitio de escisión selectivo a dicho polinucleótido que codifica dicho polipéptido en el extremo carboxi terminal.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el sitio de escisión de selección comprende el sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, que comprende adicionalmente escindir dicho sitio de escisión de selección antes de purificar dicho polipéptido.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido es una25 proteína de Transferencia de Ésteres de Colesterol o una proteína Lipasa Endotelial.


 

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