Nuevos anticuerpos monoclonales estimuladores o bloqueadores de la tiroides, secuencias peptídicas que corresponden a sus regiones variables, y sus usos en medicina diagnóstica, preventiva y terapéutica.

Anticuerpos monoclonales (mAbs) que tienen actividad estimuladora de la tiroides (TSAb),

cuyos anticuerpos monoclonales son obtenibles mediante inmunización genética de ratones contra el receptor de TSH humano (hTSHr), selección de los ratones que dan positivo para la presencia de anticuerpos, generación de hibridomas usando células del bazo de los ratones seleccionados, y expansión, ensayo y selección de los clones de hibridomas que producen mAbs o fragmentos F(ab')2, Fab o Fv de tales anticuerpos monoclonales, cuyos anticuerpos son producidos por células de hibridomas depositadas al amparo del Tratado de Budapest del 27 de mayo de 2004 en la DSMZ de Braunschweig con los Números de Accesión DSM ACC2664 y DSM ACC2662.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E04015239.

Solicitante: B.R.A.H.M.S GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: NEUENDORFSTRASSE 25 16761 HENNIGSDORF ALEMANIA.

Inventor/es: BERGMANN, ANDREAS, VASSART, GILBERT, MORGENTHALER,NILS G, Costagliola,Sabine.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/395 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • C07K16/28 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.

PDF original: ES-2382627_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Nuevos anticuerpos monoclonales estimuladores o bloqueadores de la tiroides, secuencias peptídicas que corresponden a sus regiones variables, y sus usos en medicina diagnóstica, preventiva y terapéutica.

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen al receptor de tirotropina (TSHr) y tienen actividades estimuladoras o bloqueadoras, a características secuencias de aminoácidos y a otras características de dichos nuevos mAbs, y a varios usos de tales mAbs o sus fragmentos que se unen específicamente en medicina, así como a usos en campos afines que sean concebibles en vista de la exacta información que se da a conocer con respecto a su comportamiento en materia de unión y a sus características estructurales y secuenciales.

Junto con los receptores de lutropina/corigonadotropina (LH/CGr) y de folitropina (FSHr) , el receptor de tirotropina (TSHr) constituye la subfamilia de receptores de hormonas glicoproteínicas (GPHR) , que son a su vez miembros de la gran familia de receptores acoplados a proteínas G tipo rodopsina (GPCR) . Los GPHRs albergan a un gran dominio Nterminal extracelular que es responsable de la especificidad de reconocimiento y unión de hormonas, y a una región transmembrana heptahelicoidal que comparten con todos los GPCRs. Esta parte "serpentina" es responsable de la transmisión de la señal de activación, principalmente a la proteína G Gs. El dominio extracelular se compone de dos agrupaciones ricas en cisteína que flanquean a nueve repeticiones ricas en leucina (LRRs) . Se ha propuesto un modelo estructural de la parte LRR del ectodominio del TSHr, basado en la estructura cristalina del inhibidor de ribonucleasa porcina (1) . El mismo toma la forma de un segmento de herradura, hecho de una sucesión de hebras beta y hélices alfa, en las superficies cóncava y convexa de la herradura, respectivamente. Según los conocimientos actuales, se piensa que los GPHRs son activados por su respectivo ligando (TSH, LH/CG, FSH) tras la interacción de la subunidad beta de las hormonas con residuos específicos de las hebras beta de la herradura.

En contraste con los receptores de LH/CG y de FSH, el TSHr puede también ser activado por autoanticuerpos dirigidoscontra su ectodominio (1) . Ésta es la causa inmediata de la tirotoxicosis y de la hiperplasia de la tiroides en pacientes con la enfermedad de Graves (5, 6) . Tras la publicación de la secuencia completa de aminoácidos del TSHr humano (hTSHr) y de variantes del TSHr de otros mamíferos, fueron generados en distintos animales numerosos anticuerpos contra el TSHr completo o sus secuencias parciales, pero durante mucho tiempo siguieron siendo difíciles de conseguir anticuerpos que tengan propiedades estimuladores de la tiroides y sean agonistas del TSHr.

Los anticuerpos generados en su mayoría presentaban actividad bloqueadora, es decir que eran capaces de disminuir o bloquear, en bioensayos, el efecto estimulador de la TSH en el TSHr. Unos pocos de entre ellos también resultaron ser potentes competidores de los autoanticuerpos estimuladores hallados en sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes de la tiroides, y en especial con enfermedad de Graves. Se describen y se reivindican en la Patente Alemana DE 199 07 094 C1 y en la correspondiente WO 00/49050 A2/A3 tales mAbs bloqueadores, y más específicamente mAbs que se unen a epítopes que comprenden los aminoácidos FDSH, que corresponden a los aminoácidos 381 a 384 del TSHr humano (hTSHr) . Dicha patente también reivindica el uso de anticuerpos bloqueadores para el tratamiento del hipertiroidismo y de condiciones afines.

Tras años de intentos infructuosos, finalmente han sido desarrollados modelos murinos de la enfermedad de Graves (GD) (7 - 10) y esto ha abierto recientemente el camino al aislamiento de un número limitado de anticuerpos monoclonales (mAbs) con actividad estimuladora de la toroides (TSAb) (11 - 13) . Se demostró que estos mAbs estimulan al TSHr a nivel nanomolar ex vivo, y que al ser comparados con TSH bovina o humana los mismos actuaban como agonistas parciales. Por último, recientemente ha sido generado a partir de linfocitos periféricos de un paciente con enfermedad de Graves (14) un único mAb humano con actividad de TSAb. En ninguno de estos casos han sido delineados con precisión los epítopes reconocidos por los mAbs.

Los mAbs con actividad de TSAb constituyen inapreciables herramientas científicas para sondear los mecanismos implicados en la transducción intramolecular de la señal de activación entre el ectodominio del TSHr y otros GPHRs y su dominio serpentino. Sin embargo, tales anticuerpos, al ser potenciales agonistas del TSHr, también pueden ser considerados como candidatos para una serie de usos en medicina diagnóstica y terapéutica para los cuales se usa en la actualidad TSH, ya sea al desnudo o bien etiquetada o bien en forma de conjugados. Uno de tales usos corresponde al uso de TSH, habitualmente como TSH recombinante (p. ej. como Thyrogen®, tirotropina alfa para inyección, Genzyme Therapeutics) , como herramienta diagnóstica auxiliar para pruebas de la tiroglobulina (Tg) sérica con o sin exploración de todo el cuerpo (WBS) con radioyodo en el seguimiento de pacientes con un historial de cáncer de tiroides bien diferenciado para detectar la presencia de restos de cáncer o de cáncer residual o recurrente tras tiroidectomía o tratamiento con radioyodo.

En diagnosis, adecuados anticuerpos que compiten con autoanticuerpos patogénicos presentes en la circulación de pacientes afectados por enfermedades autoinmunes de la tiroides, o con poblaciones específicas de tales autoanticuerpos, ya eran considerados como potenciales alternativas a la TSH competidora convencional en ensayos para la determinación de autoanticuerpos, y más específicamente para TSH bovina (bTSH) etiquetada, que se usa en la actualidad en el aplastante número de inmunoensayos competitivos para la determinación de autoanticuerpos para el TSHr (TRAb) . Tales usos de anticuerpos como competidores están por ejemplo descritos en la EP 1 301 767 A1 (determinación de autoanticuerpos bloqueadores) de los solicitantes, o en la PCT/EP03/12129 (WO 04/048415) , que describen, inter alia, el uso de anticuerpos humanos policlonales etiquetados purificados por afinidad como competidores en tales ensayos. Ambas solicitudes describen que el uso de anticuerpos como competidores en comparación con el uso de TSH puede proporcionar ciertas ventajas significativas, p. ej. con respecto a una deseada selectividad de una determinación o a la estabilidad de la unión específica del competidor a preparaciones de TSHr tras un prolongado almacenamiento del kit (kit = conjunto de materiales y utensilios) de ensayo.

Para ser útiles como alternativas a la TSH en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, los mAbs preferiblemente deben unirse, con la afinidad apropiada, a partes del TSHr implicadas en la unión de la TSH y en la unión de los autoanticuerpos, respectivamente. A efectos terapéuticos o de diagnosis in vivo la actividad agonística estimuladora o bien como alternativa la actividad bloqueadora de tales mAbs preferiblemente deberá ser del mismo orden de magnitud como la de la TSH y la de los autoanticuerpos respectivamente, y debe ser observable también bajo condiciones fisiológicas, p. ej. a concentraciones salinas fisiológicas.

La presente invención aporta, inter alia, una nueva clase de mAbs bien definidos contra el TSHr que satisfacen los requisitos anteriormente expuestos y tienen otras propiedades y ventajas que le resultarán obvias a un experto en la materia al proceder a la lectura de la descripción siguiente.

La invención, por consiguiente, según uno de sus principales aspectos aporta anticuerpos monoclonales (mAbs) según la reivindicación 1 que tienen actividad estimuladora de la tiroides (TSAb) , o bien que según la reivindicación 2 son anticuerpos bloqueadores de la tiroides. Dichos anticuerpos monoclonales son obtenibles mediante inmunización genética de ratones contra el receptor de TSH humano (hTSHr) , selección de los ratones que dan positivo para la presencia de anticuerpos que estimulan o bloquean al hTSHr, generación de hibridomas usando células del bazo de los ratones seleccionados, y expansión, pruebas y selección de los clones de hibridomas que producen mAbs que tienen actividad estimuladora o bloqueadora de la tiroides. La invención también aporta los fragmentos F (ab') 2, Fab o Fv.

Todos los anticuerpos o sus fragmentos están caracterizados por una combinación de las características siguientes:

a. Compiten con la TSH bovina por los epítopes del... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Anticuerpos monoclonales (mAbs) que tienen actividad estimuladora de la tiroides (TSAb) , cuyos anticuerpos monoclonales son obtenibles mediante inmunización genética de ratones contra el receptor de TSH humano (hTSHr) , selección de los ratones que dan positivo para la presencia de anticuerpos, generación de hibridomas usando células del bazo de los ratones seleccionados, y expansión, ensayo y selección de los clones de hibridomas que producen mAbs o fragmentos F (ab') 2, Fab o Fv de tales anticuerpos monoclonales, cuyos anticuerpos son producidos por células de hibridomas depositadas al amparo del Tratado de Budapest del 27 de mayo de 2004 en la DSMZ de Braunschweig con los Números de Accesión DSM ACC2664 y DSM ACC2662.

2. Anticuerpos monoclonales (mAbs) que tienen actividad bloqueadora de la tiroides (TBAb) , cuyos anticuerpos monoclonales son obtenibles mediante inmunización genética de ratones contra el receptor de TSH humano (hTSHr) , selección de los ratones que dan positivo para la presencia de anticuerpos, generación de hibridomas usando células del bazo de los ratones seleccionados, y expansión, ensayo y selección de los clones de hibridomas que producen mAbs o fragmentos F (ab') 2, Fab o Fv de tales anticuerpos monoclonales, cuyos anticuerpos son producidos por células de hibridomas depositadas al amparo del Tratado de Budapest el 27 de mayo de 2004 en la DSMZ de Braunschweig con el Número de Accesión ACC2663.

3. Anticuerpos o fragmentos según la reivindicación 1, caracterizados por el hecho de que los mAbs pertenecen al isotipo de IgG IgG2A y contienen una cadena pesada según la ID SEC Nº: 1 y una cadena liviana según la ID SEC Nº: 2, o son fragmentos derivados de tales anticuerpos.

4. Anticuerpos o fragmentos según la reivindicación 1, caracterizados por el hecho de que los mAbs pertenecen al isotipo de IgG IgG1 y contienen una cadena pesada según la ID SEC Nº: 9 y una cadena liviana según la ID SEC Nº: 10, o son fragmentos derivados de tales anticuerpos.

5. Uso de anticuerpos o fragmentos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en inmunoensayos competitivos in vitro o en bioensayos in vitro para la determinación de autoanticuerpos contra el receptor de TSH (TRAb) .

6. Uso según la reivindicación 5, en donde los anticuerpos o fragmentos llevan una etiqueta que permite una detección de sus preparaciones de unión al TSHr.

7. Uso de anticuerpos o fragmentos según las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichos anticuerpos están etiquetados o llevan un radioisótopo que permite la obtención de imágenes in vivo de tejido y/o células que presentan el TSHr.

 

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