NUEVOS ACTIVADORES DEL PLASMINOGENO QUIMERICOS Y SUS USOS FARMACEUTICOS.

Una proteína de fusión que comprende:

(a) un precursor de proteína surfactante hidrófoba pulmonar de mamífero que carece de su polipéptido C-terminal,

y

(b) un activador del plasminógeno de mamífero,

en la que el precursor de proteína surfactante está fusionado en su extremo C al extremo N del activador del plasminógeno

Nuevos activadores del plasminógeno quiméricos y sus usos farmacéuticos.

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas recombinantes que comprenden un precursor de proteína surfactante fusionado en el extremo N-terminal a un activador del plasminógeno o que comprenden una proteína surfactante madura fusionada en el extremo N-terminal o C-terminal a un activador del plasminógeno.

Numerosas enfermedades pulmonares intersticiales inflamatorias agudas y crónicas, tales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), lesión pulmonar aguda (ALI), enfermedad pulmonar intersticial (ILD) o fibrosis pulmonar idiopática (IPF), se caracterizan por anormalidades surfactantes sustanciales, por ejemplo alteraciones en la composición de surfactantes, filtración de proteínas del plasma al espacio alveolar, o acumulación intra-alveolar de fibrina (revisada en [1, 2]).

En estas condiciones patológicas, el equilibrio hemostático alveolar se desplaza hacia un predominio de actividades pro-coagulantes y anti-fibrinolíticas, mientras que la actividad fibrinolítica del espacio alveolar se reduce marcadamente, con niveles reducidos de activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (u-PA; también denominado uroquinasa), el activador del plasminógeno predominante en este compartimento, pero concentraciones elevadas de inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) y a₂-antiplasmina [3-5]. En dicho entorno, el fibrinógeno que se filtra al espacio alveolar debido a una función alterada de la barrera alveolocapilar (constituida por el endotelio capilar, el espacio intersticial, y el epitelio alveolar) se convierte rápidamente en fibrina, y se observa acumulación de fibrina alveolar.

La función de la formación de fibrina en el espacio alveolar es en gran medida desconocida. Ésta puede tener efectos beneficiosos en la prevención de la hemorragia pulmonar y servir como matriz primaria en la reparación de heridas. Por otro lado, la fibrina alveolar puede contribuir a la alteración del intercambio gaseoso en la lesión pulmonar aguda, y una eliminación con retraso de la fibrina alveolar puede proporcionar una matriz provisional para la posterior invasión de fibroblastos así como la producción de proteínas de la matriz extracelular y, de este modo, promover la respuesta fibroproliferativa que caracteriza una evolución prolongada de ARDS y fibrosis pulmonar (revisado en [6-8]).

El surfactante pulmonar es un complejo de lipoproteínas que cubre la superficie alveolar de todos los pulmones de mamíferos (revisado en [9, 10]). Al reducir la tensión superficial en el interfaz de aire/líquido a niveles muy bajos, hace a la ventilación alveolar y el intercambio gaseoso factibles a presiones pulmonares fisiológicas bajas y evita que los alvéolos se replieguen sobre sí mismos. El surfactante pulmonar está compuesto por aproximadamente el 90% de lípidos y el 10% de proteínas. De los lípidos, el 80-90% son fosfolípidos, con fosfatidilcolina como componente más abundante. Hasta la fecha, se han identificado cuatro proteínas asociadas a surfactante que pueden dividirse en dos grupos: las proteínas surfactantes hidrófilas (SP) SP-A y SP-D, y las proteínas surfactantes hidrófobas SP-B y SP-C (revisado en [11, 12]).

En los últimos años, la aplicación de preparaciones de surfactante exógeno se ha convertido en un enfoque interesante para restaurar la disfunción del surfactante en afecciones patológicas, tales como ARDS o IRDS. Por ejemplo, la Solicitud Internacional PCT [13] divulga una preparación farmacéutica para tratar síndrome de dificultad respiratoria del lactante o lesión pulmonar aguda, que comprende al menos una modificación de SP-B y al menos una modificación de SP-C. Los autores han descubierto que añadiendo modificaciones de SP-C a preparaciones de surfactante pulmonar que contienen modificaciones de SP-B, se obtienen preparaciones farmacéuticas con propiedades ventajosas. Las modificaciones de las proteínas surfactantes pueden ser proteínas recombinantes. La Patente de Estados Unidos [14] describe una composición para administración por vía pulmonar de un compuesto farmacéuticamente activo que comprende un compuesto formador de liposomas, así como al menos una proteína surfactante alveolar en una cantidad eficaz para mejorar el transporte de los liposomas a lo largo de una superficie pulmonar. Finalmente, la Patente de Estados Unidos [15] describe varios fragmentos de SP-B que muestran actividad surfactante cuando se mezclan con fosfolípidos. Estos fragmentos son compuestos adecuados para la preparación de formulaciones terapéuticamente eficaces para el tratamiento de una enfermedad respiratoria.

Se supone que las anormalidades surfactantes representan sucesos clave en el desarrollo del fallo respiratorio agudo y crónico. La alteración de la función surfactante biofísica con una tensión superficial mínima aumentada y perfiles de fosfolípidos y proteínas surfactantes alterados se han observado de forma sistemática en pacientes con ARDS, neumonía grave así como enfermedad pulmonar intersticial (revisado en [1, 2]). Además, se ha establecido que la formación de fibrina alveolar representa el mecanismo inhibidor de surfactante más potente descrito hasta el momento. La generación de un coágulo de fibrina en presencia de surfactante pulmonar dio como resultado una incorporación casi completa de componentes surfactantes hidrófobos, tales como fosfolípidos y las proteínas surfactantes SP-B y SP-C, en la matriz de fibrina naciente junto con una grave pérdida de propiedades rebajantes de la tensión superficial. Además, la fibrina que contiene surfactante representa una estructura única dentro del espacio alveolar con distintas propiedades. En comparación con coágulos de fibrina "normales" (extra-alveolares), los coágulos de fibrina alveolares se caracterizan por una arquitectura del coágulo alterada, propiedades mecánicas alteradas y una susceptibilidad reducida a la degradación proteolítica (revisado en [1]).

Por lo tanto, una corrección del desequilibrio hemostático descrito anteriormente aumentando la actividad fibrinolítica alveolar puede representar un enfoque terapéutico razonable para restaurar la función surfactante. Y de hecho, estudios in vivo e in vitro han tenido éxito en la consecución de este objetivo. Una regulación positiva de los niveles de uroquinasa mediante transferencia génica mediada por adenovirus redujo el grado de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones [16]. Además, en pulmones de conejo perfundidos al tratamiento con uroquinasa le seguía una mejora pronunciada del intercambio gaseoso [17]. Se demostró que la escisión in vitro de fibrina que incorpora surfactante rescata material surfactante atrapado en la matriz de fibrina, con sus propiedades rebajadoras de la tensión superficial estando conservadas [18, 19].

Esta estrategia, sin embargo, podría estar dificultada por la inducción de hemorragia en sitios pulmonares y extra-pulmonares, incluso si el agente fibrinolítico está distribuido principalmente en el espacio alveolar. Además, podrían provocarse efectos desfavorables sobre la función surfactante. Para superar estas limitaciones, deben desarrollarse herramientas que mejoren la selectividad y potencia de una terapia fibrinolítica contra fibrina que contiene surfactante.

Ruppert y col., han establecido recientemente dicha herramienta molecular para fijar como objetivo la fibrina alveolar acoplando químicamente un anticuerpo monoclonar anti-SP-B, denominado 8B5E, para uroquinasa humana usando un reticulador heterobifunctional [20]. En otro estudio [21], los mismos autores describieron reticulación química de uroquinasa humana con SP-B bovina purificada. Se descubrió que ambas de estas proteínas híbridas: (1) conservan las actividades biofísicas en comparación con SP-B nativa, y (2) son aproximadamente 2-3 veces más eficaces en la lisis de coágulos de fibrina que contienen surfactante y aproximadamente 3-5 veces más resistentes a PAI-1 que u-PA nativo, dando como resultado, por lo tanto, enzimas quiméricas con especificidad por el sustrato mejorada. Por otro lado, debido al esfuerzo necesario para purificar las proteínas, en particular con respecto a SP-B, que se purifica a partir de una fuente natural, que se acoplará mediante métodos de purificación convencionales, esta estrategia requiere tiempo y es bastante laboriosa. Esta desventaja, sin embargo, puede superarse parcialmente mediante la producción recombinante de las dos proteínas aisladas (por ejemplo uroquinasa y SP-B), seguida de su reticulación química.

Para este fin, podría...

1. Una proteína de fusión que comprende:

en la que el precursor de proteína surfactante está fusionado en su extremo C al extremo N del activador del plasminógeno.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que uno de los componentes de la proteína (a) o (b) es una proteína humana.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 ó 2, en la que ambos componentes de la proteína (a) y (b) son proteínas humanas.

4. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el precursor de proteína surfactante pulmonar de mamífero se selecciona entre la proteína surfactante B (SP-B) o la proteína surfactante C (SP-C).

5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el precursor de proteína surfactante pulmonar de mamífero es la proteína surfactante B (SP-B).

6. Una proteína de fusión que comprende:

en la que la proteína surfactante madura está fusionada en su extremo C o su extremo N al extremo N o al extremo C del activador del plasminógeno, respectivamente.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, en la que uno de los componentes de la proteína (a) o (b) es una proteína humana.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 6 ó 7, en la que ambos componentes de la proteína (a) y (b) son proteínas humanas.

9. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que la proteína surfactante pulmonar de mamífero madura se selecciona entre el grupo constituido por la proteína surfactante B (SP-B) y la proteína surfactante C (SP-C).

10. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que la proteína surfactante pulmonar de mamífero madura es la proteína surfactante B (SP-B).

11. Una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el activador del plasminógeno de mamífero se selecciona entre el grupo constituido por activador del plasminógeno de tipo uroquinasa de cadena doble de alto peso molecular (HMW-u-PA), u-Pa de cadena doble de bajo peso molecular (LMW-u-PA), cadena B de u-PA de bajo peso molecular, u-Pa de cadena sencilla recombinante (r-scu-PA), activador del plasminógeno tisular (t-PA), t-PA recombinante (rt-PA), sus variantes r-PA, n-PA y TNK-t-PA, y fragmentos y mutantes de los mismos que tienen actividad de activador del plasminógeno.

12. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende el precursor de la proteína surfactante B (SP-B) fusionado en el extremo N-terminal al u-Pa de cadena doble de bajo peso molecular (LMW-u-PA), como se muestra en la SEC ID Nº 19 y en la SEC ID Nº 20, respectivamente.

13. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que comprende la proteína surfactante madura B (SP-B) fusionada al u-Pa de cadena doble de bajo peso molecular (LMW-u-PA), como se muestra en la SEC ID Nº 25 y en la SEC ID Nº 26, respectivamente.

14. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que porta una marca de afinidad proteica o peptídica en su extremo N y/o en su extremo C.

15. Una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-14.