NUEVO MÉTODO DE CLONACIÓN Y MUTAGÉNESIS IN VITRO MEDIANTE PCR INVERSA DE CLONACIÓN.
Nuevo método de clonación y mutagénesis in vitro mediante PCR inversa de clonación.
La presente invención se refiere a un nuevo método de clonación dirigida o de clonación y mutagénesis dirigidas y simultáneas que comprende una primera PCR clásica con unos cebadores cuya secuencia hibrida en parte con el inserto y en parte con el vector deseado y puede contener mutaciones, y una segunda PCR inversa de clonación que usa directamente los amplicones generados en la PCR clásica generando nuevos amplicones bicatenarios de largos extremos cohesivos complementarios que circularizan in situ en forma de construcciones génicas estables tipo vector, que ya contienen el fragmento de ADN donado en el vector deseado directamente. La presente invención se refiere también a un kit que comprende las instrucciones para llevar a cabo dicho método y al uso del kit para la clonación dirigida o la clonación y mutagénesis dirigidas y simultáneas.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201130222.
Solicitante: UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: DOMÍNGUEZ GERPE,Mª LOURDES.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2387167_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Nuevo método de clonación y mutagénesis in vitro mediante PCR
inversa de clonación
La presente invención pertenece al campo de la Biología Molecular, la Ingeniería Genética y la Biotecnología. La presente invención se refiere a un nuevo método in vitro para la clonación dirigida o para la clonación dirigida y la mutagénesis dirigida simultánea, usando una PCR inversa de clonación (CiPCR) . Además, la presente invención se refiere a un kit que comprende las instrucciones para llevar a cabo dichos métodos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La clonación de un inserto o fragmento de ADN en un vector consiste en unir los correspondientes extremos 5' y 3' del fragmento de ADN a los correspondientes sitios 3' y 5' del vector, respectivamente. La construcción génica circular generada es un vector que puede ser introducido en una célula, donde se replica cuando la célula es cultivada, de forma que su progenie lo hereda, permitiendo de esta manera la obtención de muchas copias idénticas o clones de dicho fragmento de ADN contenido en el nuevo vector.
Las técnicas usadas mayoritariamente para la clonación de fragmentos de ADN en un vector son muy variadas y se pueden clasificar, según la metodología a usar, en cinco tipos comúnmente conocidos como: métodos de ligamiento de extremos romos, métodos de restricción, métodos de clonación T-A, métodos de recombinación, y métodos LIC (método de clonación independiente de ligasas, del inglés "ligation independent cloning'}.
Los métodos de ligamiento de extremos romos se basan en el uso de enzimas de restricción cuyos productos tienen extremos romos. Estos métodos son fáciles de entender, pero experimentalmente son lentos y tediosos, y no permiten la clonación de forma dirigida de manera fácil y eficiente. Entre sus mayores limitaciones están que dependen de la presencia de las secuencias diana tanto en el inserto como en el vector, que no permiten usar directamente amplicones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con residuos de desoxiadenosina en su extremo 3', que falta información acerca de las secuencias flanqueantes a las dianas de determinadas enzimas de restricción y que la eficiencia de la ligasa de ADN a la hora de unir extremos romos es baja.
Los métodos de restricción se basan en el uso de enzimas de restricción cuyos productos tienen extremos cohesivos o protuberantes (en el ADN bicatenario un cierto número de residuos del extremo de la cadena correspondiente sobresale en forma de cadena sencilla) . Estos métodos son fáciles de entender, permiten la clonación tanto dirigida como no dirigida del inserto, y una ligación eficiente del inserto al vector. Sin embargo, presentan importantes limitaciones, como la necesidad de que tanto el vector como el inserto presenten las secuencias diana en los sitios adecuados, la falta de información acerca de las secuencias flanqueantes a las dianas de determinadas enzimas de restricción, el hecho de que cuando se usa una única enzima de restricción solamente se puede clonar de forma no dirigida,
o que la clonación del inserto de forma dirigida requiere el uso de dos enzimas de restricción diferentes. Esto último conlleva un mayor número de pasos experimentales, y sobre todo puede suponer un inconveniente debido a la incompatibilidad de las dianas presentes en el vector deseado y en el inserto. Generalmente, la clonación por restricción requiere un estudio previo exhaustivo de la estrategia a seguir y de los vectores a utilizar, ocasionando una notable pérdida de tiempo, acrecentada cuando la disposición de las secuencias diana obliga a la clonación del inserto en un primer vector y a la transferencia del inserto a un segundo vector o vector deseado.
Los métodos de clonación T -A y similares se basan en la hibridación del inserto con el vector bien a través de residuos de desoxiadenosinas en los extremos 3' protuberantes del inserto que hibridan con residuos de desoxitimidinas en los extremos 3' protuberantes del vector, o a través de secuencias especiales añadidas, o mediante activaciones de otros residuos terminales. Estos métodos emplean vectores comerciales abiertos en los que se insertan productos de PCR directamente, la mayoría no permite la clonación dirigida, requieren la compra de nuevas alícuotas y generalmente es necesaria la transferencia de la secuencia clonada a un segundo vector deseado. Ejemplos de estos vectores son pGEM T y pGEM®-T Easy de Promega, que usan como insertos fragmentos de ADN con residuos de desoxiadenosina 3' protuberantes y ligasas para la unión del inserto con el vector, o el pCR®II-TOPO de lnvitrogen, que emplea fragmentos de ADN con residuos de desoxiadenosina 3' protuberantes y topoisomerasas. Igualmente, "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" también usa topoisomerasas y permite la clonación de fragmentos de ADN con extremos romos de forma no dirigida, como por ejemplo usando los fragmentos obtenidos por PCR mediante polimerasas que no introducen residuos de desoxiadenosina en los extremos 3 ·. Otros vectores como el "Directional TOPO® Cloning permiten la clonación de fragmentos de ADN directamente de forma dirigida con topoisomerasas, y para ello requieren cebadores con secuencias específicas añadidas en sus extremos.
Una alternativa al ligamiento in vitro entre el inserto y el vector, es el ligamiento in vivo. Un ejemplo es el que ocurre en bacterias que sobreexpresen la ligasa de ADN del bacteriófago T4, en las que se introduce el vector y el inserto en forma lineal para que se produzca su ligamiento dentro de la célula. Los mayores problemas de este método son la baja estabilidad de los ADN lineales dentro de las bacterias, lo que lleva a su degradación parcial y a una disminución de la eficiencia del ligamiento, o a su degradación completa, lo que lleva al fracaso.
Los métodos de recombinación pueden emplear dos estrategias: la clonación in vitro mediante recombinasas (ejemplos: la tecnología Gateway® de lnvitrogen y la tecnología ln-Fusion™ y Creator™ PCR Cloning System de Clontech) y la clonación in vivo, donde el inserto y el vector recombinan dentro de una célula por recombinación homóloga, que es muy eficiente en levaduras y recientemente también se consigue en Escherichia coli (E. coli) mediante "clonación RecET" y "clonación 'A Red". Estos métodos permiten 5 clonaciones dirigidas y evitan el empleo de enzimas de restricción y de ligasas, pero son complicados de entender y diseñar, y en ocasiones requieren el diseño y construcción de vectores de destino no comerciales; o requieren cepas especiales de bacterias, o la cotransfección con otro vector para introducir los elementos necesarios para que tenga lugar la 1 O recombinación. Además, puede haber baja eficiencia, inestabilidad de los vectores y toxicidad celular. Los métodos LIC se basan en la creación de extremos cohesivos, los más comunes contienen 12 residuos nucleotídicos, en el inserto y en el vector, 15 complementarios entre sí. Estos métodos permiten la clonación dirigida y son independientes de enzimas de restricción y de ligasas. La hibridación de los extremos cohesivos complementarios del inserto y del vector permiten su estabilización en forma circular formando una construcción génica tipo vector que al introducirla dentro de una célula es unida covalentemente por ligasas 20 intracelulares para la obtención del vector correspondiente. Sin embargo, la generación de estos extremos cohesivos es laboriosa y el almacenamiento de los productos que los contienen es problemático, ya que los extremos son susceptibles de degradación. Para la generación de los extremos cohesivos se emplean distintas estrategias: la T 4 ADN polimerasa (Aslanidis y 25 colaboradores (cols.) PCR Methods Appl. 1994 4 (3) :172-7) , la uracil ADN glicosilasa y polimerasas que no pueden amplificar desde residuos de ARN presentes en cebadores mixtos ADN-ARN. En el mercado hay vectores comerciales como por ejemplo "Affinity® LIC", 30 de Stratagene o el vector "Genscript pDream 2.1 ", pero son muy escasos. Si se requiere su preparación en el laboratorio, esta es generalmente más complicada que la preparación de los insertos.
Por otra parte, existen varias metodologías para la introducción de mutaciones dirigidas o aleatorias en la secuencia de un fragmento de ADN lineal o clonado en un vector, o en la secuencia... [Seguir leyendo]
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