Nuevas proteínas y cepas pesticidas.

LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A CEPAS Y PROTEINAS PESTICIDAS.

SE PROPORCIONAN CEPAS DE BACILLUS QUE SON CAPACES DE PRODUCIR PROTEINAS PESTICIDAS Y PROTEINAS AUXILIARES DURANTE CRECIMIENTO VEGETATIVO. TAMBIEN SE PROPORCIONAN LAS PROTEINAS PURIFICADAS, SECUENCIAS DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS Y METODOS DE UTILIZACION DE LAS CEPAS, PROTEINAS Y GENES PARA CONTROLAR PLAGAS.

Nuevas proteínas y cepas pesticidas.

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones para controlar plagas de plantas y plagas de otros organismos. Particularmente, se describen nuevas proteínas pesticidas que se pueden aislar a partir de la fase de crecimiento vegetativo de Bacillus. Se proporcionan cepas de Bacillus, proteínas y genes que codifican las proteínas. Los métodos y composiciones de la invención pueden usarse en una diversidad de sistemas para controlar plagas de plantas y plagas de otros organismos.

Las plagas de insectos son un factor importante en la pérdida de cultivos agrícolas importantes desde el punto de vista comercial en todo el mundo. Se han usado ampliamente pesticidas químicos de amplio espectro para controlar o erradicar plagas de importancia agrícola. Sin embargo, existe un interés substancial en el desarrollo de pesticidas alternativos eficaces.

Los pesticidas microbianos han jugado un papel importante como alternativas al control químico de las plagas. El producto microbiano usado más ampliamente se basa en la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). Bt es un Bacillus formador de esporas gram positivo que produce una proteína cristalina insecticida (ICP) durante la esporulación.

Se conocen numerosas variedades de Bt que producen más de 25 ICP diferentes pero relacionadas. La mayoría de las ICP fabricadas por Bt son tóxicas para las larvas de ciertos insectos de los órdenes Lepidoptera, Diptera y Coleoptera. En general, cuando una ICP se ingiere por un insecto susceptible, el cristal se solubiliza y se transforma en un resto tóxico por las proteasas intestinales del insecto. Ninguna de las ICP activas contra larvas de coleópteros tales como el escarabajo de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata) o el gorgojo amarillo de la harina (Tenebrio molitor) ha mostrado efectos significativos sobre miembros del género Diabrotica, particularmente Diabrotica virgifera virgifera, el gusano de las raíces del maíz del oeste (WCRW) o Diabrotica longicornis barberi, el gusano de las raíces del maíz del norte.

Bacillus cereus (Bc) está muy relacionado con Bt. Una característica importante que los diferencia es la ausencia de cristales de parasporas en Bc. Bc es un bacteria ampliamente distribuida que se encuentra comúnmente en el suelo y se ha aislado a partir de una diversidad de alimentos y fármacos. El organismo se ha implicado en el deterioro de los alimentos.

Aunque Bt ha sido muy útil para controlar plagas de insectos, existe la necesidad de ampliar el número de agentes que puedan ejercer un control biológico.

Dentro de la presente invención se proporcionan composiciones y métodos para controlar plagas de plantas. En particular, se proporcionan nuevas proteínas pesticidas que se producen durante el crecimiento vegetativo de cepas de Bacillus. Las proteínas son útiles como agentes pesticidas.

Más específicamente, la presente invención se refiere a una cepa de Bacillus substancialmente purificada que produce una proteína pesticida durante el crecimiento vegetativo, donde dicho Bacillus no es B. sphaericus SSII-1. Se prefieren las cepas de Bacillus thuringiensis que tienen los números de acceso NRRL B-21225 y NRRL B-21439.

La invención también se refiere a una proteína específica de insectos que se puede aislar durante la fase de crecimiento vegetativo de Bacillus spp, pero preferiblemente una cepa de Bacillus thuringiensis y B. cereus, y a componentes de la misma, donde dicha proteína no es la toxina mosquitocida de B. sphaericus SSII-1. La proteína específica de insectos de la invención preferiblemente es tóxica para insectos coleópteros o lepidópteros y tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa o mayor, preferiblemente de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 kDa, y más preferiblemente de aproximadamente 80 kDa.

Más particularmente, la proteína específica de insectos de la invención tiene un espectro de actividad insecticida que incluye una actividad contra especies de Agrotis y/o Spodoptera, pero preferiblemente actividad contra el gusano cortador negro [Agrotis ipsilon; BCW] y/o la palomilla del maíz [Spodoptera frugiperda] y/o el gusano soldado de la remolacha [Spodoptera exigua] y/o el gusano de los brotes del tabaco y/o el gusano del fruto [Helicoverpa zea].

La proteína específica de insectos de la invención puede aislarse preferiblemente a partir de una cepa de Bacillus spp seleccionada entre los números de acceso NRRL B-21225 y NRRL B-21439.

Se prefiere una proteína específica de insectos que tenga una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 2 y la SEC ID Nº: 5, incluyendo cualquier proteína que sea estructural y/o funcionalmente homóloga a la misma.

Otra realización preferida de la invención comprende una proteína específica de insectos de la invención donde se han retirado o inactivado las secuencias que representan la señal de secreción.

La presente invención también se refiere a proteínas pesticidas multiméricas, que comprenden más de una cadena polipeptídica y donde al menos una de dichas cadenas polipeptídicas representa una proteína específica de insectos de la invención y al menos otra de dichas cadenas polipeptídicas representa una proteína auxiliar de la invención, que activa o potencia la actividad pesticida de dicha proteína específica de insectos.

Las proteínas pesticidas multiméricas de acuerdo con la invención preferiblemente tienen un peso molecular de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 200 kDa.

La presente invención también se refiere a proteínas de fusión que comprenden varios dominios de proteína que incluyen al menos una proteína específica de insectos de la invención que, cuando se traduce por los ribosomas, produce una proteína de fusión con al menos los atributos combinados de la proteína específica de insectos de la invención y, opcionalmente, de los otros componentes usados en la fusión.

Como se usa en la presente solicitud, una homología de secuencias substancial significa una relación estructural estrecha entre secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, las proteínas substancialmente homólogas pueden tener una homología del 40%, preferiblemente del 50% y más preferiblemente del 60% o del 80% o mayor. La homología también incluye una relación en la que están ausentes una o varias subsecuencias de aminoácidos, o están intercaladas subsecuencias con aminoácidos adicionales.

Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína específica de insectos que se puede aislar durante la fase de crecimiento vegetativo de Bacillus spp. y a componentes de la misma, donde dicha proteína no es la toxina mosquitocida de B. sphaericus SSII-1. En particular, la presente invención se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína específica de insectos, donde el espectro de actividad insecticida incluye una actividad contra especies de Agrotis y/o Spodoptera, pero preferiblemente una actividad contra el gusano cortador negro [Agrotis ipsilon; BCW] y/o la palomilla del maíz [Spodoptera frugiperda] y/o el gusano soldado de la remolacha [Spodoptera exigua] y/o el gusano de los brotes del tabaco y/o el gusano del fruto [Helicoverpa zea].

Se prefiere una molécula de ADN, donde dicha molécula comprende una secuencia de nucleótidos como la proporcionada en la SEC ID Nº:1 o en la SEC ID Nº:4, incluyendo cualquier molécula de ADN que sea estructural y/o funcionalmente homóloga a la misma.

Otra realización de la invención se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína específica de insectos que se puede aislar durante la fase de crecimiento vegetativo de Bacillus spp., y a componentes de la misma, donde dicha proteína no es la toxina mosquitocida de B. sphaericus SSII-1, habiéndose optimizado dicha secuencia de nucleótidos para la expresión en un microorganismo o una planta.

Se prefiere una molécula de ADN, donde dicha molécula comprende una secuencia de nucleótidos como la proporcionada en la SEC ID Nº:30, incluyendo cualquier molécula de ADN que... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN que codifica una proteína pesticida que se puede aislar durante la fase de crecimiento vegetativo de Bacillus spp. o variantes y fragmentos de la proteína que retienen actividad pesticida, donde dicha proteína se puede aislar a partir de un medio de cultivo líquido, y donde dicha proteína se codifica por una secuencia de nucleótidos que hibrida con una secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, 3 ó 4 a 65ºC en un tampón que comprende SDS al 7% y fosfato sódico 0,5 M, o donde dicha proteína presenta reacción cruzada con anticuerpos inducidos contra las proteínas de la SEC ID Nº: 2 ó 5.

2. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica una proteína como se define por la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6 y SEC ID Nº: 7.

3. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6.

4. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que se ha optimizado total o parcialmente para la expresión en una planta utilizando codones preferidos para plantas.

5. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 6.

6. La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que se ha optimizado total o parcialmente para la expresión en un microorganismo utilizando codones preferidos para el hospedador.

7. Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que se puede obtener por un proceso que comprende

8. Un cassette de expresión que comprende una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 unida operativamente a secuencias de expresión vegetales que incluyen las señales reguladoras de la transcripción y la traducción necesarias para la expresión de las construcciones de ADN asociadas en un organismo hospedador y, opcionalmente, secuencias reguladoras adicionales.

9. Un cassette de expresión de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el organismo hospedador es una planta.

10. Una molécula de vector que comprende un cassette de expresión de acuerdo con la reivindicación 8.

11. Una proteína pesticida codificada por una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

12. La proteína pesticida de la reivindicación 11 caracterizada porque dicha proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 60 a aproximadamente 100 kDa.

13. La proteína pesticida de acuerdo con la reivindicación 12, que tiene la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEC ID Nº: 29 o la SEC ID Nº: 32.

14. La proteína pesticida de acuerdo con la reivindicación 11, que se puede aislar durante la fase de crecimiento vegetativa de Bacillus thuringiensis AB88 depositado con el número de acceso NRRL B-21225, o Bacillus thuringiensis AB424 depositado con el número de acceso NRRL 8-21439.

15. Un organismo hospedador que comprende una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un cassette de expresión que comprende dicha molécula de ADN, o una molécula de vector que comprende dicho cassette de expresión, preferiblemente incorporado de forma estable en el genoma del organismo hospedador.

16. El organismo hospedador de acuerdo con la reivindicación 15, seleccionado entre el grupo compuesto por plantas y células de insectos, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoos, nematodos y algas.

17. El organismo hospedador de acuerdo con la reivindicación 15, que es un microorganismo transformado con un cassette de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 o una molécula de vector de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho microorganismo es preferiblemente un microorganismo que se multiplica en plantas.

18. El organismo hospedador de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria colonizadora de raíces o una cepa de Pseudomonas.

19. El organismo hospedador de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque el microorganismo es Bacillus thuringiensis AB88 depositado con el número de acceso NRRL B-21225 o Bacillus thuringiensis AB424 depositado con el número de acceso NRRL B-21439.

20. Una planta transgénica que incluye partes así como la progenie y las semillas de la misma, transformada de forma estable con una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un cassette de expresión de acuerdo con la reivindicación 9.

21. La planta de acuerdo con la reivindicación 20 que expresa una proteína pesticida de acuerdo con la reivindicación 11.

22. La planta de acuerdo con la reivindicación 21 que expresa además un segundo principio de control de insectos distinto, tal como la δ-endotoxina de Bt.

23. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20-22 a 23 que se selecciona entre el grupo compuesto por maíz, sorgo, trigo, girasol, algodón, arroz, soja, cebada y colza.

24. La planta de acuerdo con la reivindicación 23 que es una planta de maíz.

25. La planta de acuerdo con la reivindicación 23 que es una planta de algodón.

26. La planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 que es una planta híbrida.

27. Semilla de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25 tratada con un recubrimiento protector de semillas.

28. Un método para aislar una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho método

29. Un método para aumentar la gama de insectos diana, caracterizado porque un cassette de expresión de acuerdo con la reivindicación 8 se expresa en una planta junto con al menos una segunda proteína insecticida que es diferente de la proteína pesticida codificada por dicho cassette de expresión.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque la segunda proteína insecticida se selecciona entre el grupo compuesto por δ-endotoxinas de Bt, inhibidores de proteasa, lectinas, α-amilasas y peroxidasas.

31. Un método para proteger las plantas contra las lesiones producidas por una plaga de insectos que comprende plantar una planta transgénica para una molécula de ADN que codifica una proteína pesticida que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con una sonda oligonucleotídica que se puede obtener a partir de una molécula de ADN definida por la SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 35 o SEC ID Nº: 51 de acuerdo con la reivindicación 1 y que expresa la proteína pesticida.

32. Un método para producir una planta o una célula vegetal que expresa una proteína pesticida que comprende transformar dicha planta o célula vegetal con un cassette de expresión de acuerdo con la reivindicación 9 o una molécula de vector de acuerdo con la reivindicación 10.