Nuevas cepas del virus Chikungunya aisladas y purificadas y polinucleótidos y secuencias polipeptídicas, usos diagnósticos e inmunogénicos de las mismas.

Una cepa natural aislada y purificada 05.115 de virus chikungunya (CHIKV) capaz de infectar in vitro células humanas,

y donde su genoma consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4.

Nuevas cepas del virus Chikungunya aisladas y purificadas y polinucleótidos y secuencias polipeptídicas, usos diagnósticos e inmunogénicos de las mismas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a cepas naturales del virus Chikungunya aislado de pacientes que exhiben formas graves de infección y que derivan de una epidemia de arbovirosis humana. La presente invención también se refiere a secuencias de polipéptido y a fragmentos de las mismas derivados de su genoma, al polinucleótido que las codifica y a su uso en productos de diagnóstico, tales como vacunas y/o composiciones inmunogénicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus Chikungunya (CHIKV) es un Alfavirus transmitido por mosquitos que pertenece a la familia de los Togaviridae [1, 2]. Se aisló por vez primera en un brote en Tanzania en 1952 [3]. Es responsable de una infección aguda de inicio brusco, que se caracteriza por fiebre elevada, artralgia, mialgia, dolor de cabeza y sarpullido [4, 5]. La poliartralgia, el síntoma patognomónico de la enfermedad, es muy dolorosa. Generalmente los síntomas son autolimitantes y duran de 1 a 10 días. Sin embargo, la artralgia o los síntomas artríticos pueden persistir durante meses o años. En algunos pacientes, también se han descrito síntomas hemorrágicos menores tales como epistaxis o gingivorragia.

El CHIKV se distribuye geográficamente en África, India y Sudeste Asiático. En África, el virus se mantiene a través del ciclo de transmisión selvático entre primates salvajes y mosquitos tales como Aedes luteocephalus, Ae. furcifer o Ae. taylori [4]. En Asia, el CHIKV se transmite principalmente de humano a humano mediante Ae. aegypti y en menor extensión mediante Ae. albopictus a través de un ciclo de transmisión urbana. Desde el brote de 1952 en Tanzania, el CHIKV ha causado brotes en el África Oriental (Tanzania, Uganda) , en el África Austral (Zimbabue, Sudáfrica) , en el África Occidental (Senegal, Nigeria) y en el África Central (República Centroafricana, República Democrática del Congo) [4]. La re-emergencia epidémica más reciente se documentó en 1999-2000 en Kinshasa, donde se estima que se infectaron unas 50.000 personas [6]. Desde el primer brote documentado de Asia en 1958 en Bangkok, Tailandia, se han documentado brotes en Tailandia, Camboya, Vietnam, Laos, Myanmar, Malasia, Filipinas e Indonesia [4, 5]. La re-emergencia epidémica más reciente se documentó en 2001-2003 en Java después de 20 años [7]. Tanto en África como en Asia, la re-emergencia fue impredecible, con intervalos de entre 7-8 años y 20 años entre epidemias consecutivas.

Desde el final de 2004, el virus Chikungunya (CHIKV) ha emergido en las islas del Océano Índico suroccidental. Entre enero y marzo de 2005, han sido referidos más de 5.000 casos en Comoros. A finales de 2.005, el virus ha circulado por otras islas, esto es, Mayotte, Seychelles, Reunión y Mauricio. Al comienzo de diciembre de 2005, la estación de lluvias dio lugar a una circulación epidémica renovada del virus. Entre el 1 de enero y el 1 de marzo de 2006 se contabilizaron 2.553, 3.471 y 4.650 casos en Mauricio, Mayotte y Seychelles (12 de marzo de 2006) . La isla más afectada fue Reunión, con una estimación de 212.000 casos hasta el 12 de marzo de 2006 (población total: 770.000) . Más recientemente, se ha documentado la circulación del virus en Madagascar.

En Isla Reunión los primeros casos documentados fueron pacientes que procedían de Comoros en Marzo de 2005. Entre marzo y junio se documentaron más de 3.000 casos. La transmisión se vio limitada durante la temporada de invierno del hemisferio sur y desde mediados de diciembre se observó una resurgencia importante, estimándose 210.000 casos entre enero y marzo de 2006 [8]. Desde marzo de 2005, 85 pacientes con infección de CHIKV confirmada han desarrollado síntomas clínicos graves (meningoencefalitis o hepatitis fulminante) que justificaron la hospitalización en una unidad de cuidados intensivos. Varios casos de meningo-encefalitis y síndrome álgico grave han sido asociados a una transmisión vertical del virus 9.

Hasta la fecha, se han determinado dos secuencias de nucleótidos del CHIKV completas, para las cepas Ross (nº de acceso: AF490259) y S27 [9], ambas aisladas de pacientes durante el brote de 1952 en Tanzania. Se ha determinado otra secuencia de nucleótidos completa para una cepa aislada en Ae. furcifer durante el brote de 1983 en Senegal (nº de acceso AY726732) . Khan y colaboradores [9] demostraron que el genoma de S27 era similar en estructura al de otros alfavirus, y que el virus O’nyong-nyong (ONN) era el pariente más próximo al CHIKV. Adicionalmente, análisis filogenéticos basados en secuencias parciales E1 procedentes de elementos aislados de África y Asia revelaron la existencia de tres filogrupos de CHIKV distintos, uno que contenía todos los elementos aislados de África Occidental, uno que contenía los elementos aislados de Asia, y uno correspondiente a los elementos aislados de África Oriental, Central y del Sur [10]. Las cepas aisladas en 1999-2000 en la República Democrática del Congo pertenecían al último filogrupo [6].

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 es proporcionar nuevas herramientas diagnósticas e inmunológicas contra enfermedades asociadas al virus CHIK, tal como la arbovirosis.

Dicho aspecto se alcanza de manera concreta proporcionando una cepa natural aislada y purificada del virus Chikungunya (CHIK) capa de infectar células humanas in vitro; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.

Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a una cepa aislada y purificada de CHIKV que comprende al menos una mutación en la proteína estructural E1 y/o en la proteína estructural E2; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.

Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un polinucleótido aislado y purificado de la secuencia de SEQ ID NO: 1; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.

Otro aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un fragmento del polinucleótido de la invención donde codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2 ó E1; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.

Otros aspectos de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un vector que comprende un fragmento contemplado por la presente invención, y una célula hospedante que comprende dicho vector; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.

Otro aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere a un polipéptido purificado codificado por un fragmento de la invención; y su uso para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus, o para la preparación de una composición que evite y/o trate un arbovirus.

Un aspecto adicional de la invención tal como se define en las reivindicaciones 1-13 se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento del mismo que se une específicamente a un polipéptido de la invención para la detección de un CHIKV asociado a un arbovirus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Localización de los cambios de E1 sobre la estructura 3D modelizada a partir de la estructura cristalina de SFV E1 [43] [19].

A) Diagrama de cinta de la E1, con el dominio I de color rojo, el dominio II amarillo y el dominio III, azul. Los tubos verdes marcan enlaces de disulfuro. El péptido de fusión, en la punta de la molécula (en el dominio II) está en color naranja y marcado. El extremo N y el extremo C observados en el cristal (que están 30 aa por encima de la región trans-membrana) también están marcados. Los 2 únicos cambios observados en el Océano Índico están indicados por estrellas y están marcados: posiciones 226 (blanco) y 284 (magenta) .

B) Representación parcial (un octante, ligeramente extendido) de la estructura icosahédrica de la E1 en la superficie del virión, vista bajo un eje de simetría de 5 aumentos. Un promotor de E1 está resaltado en colores, como en A) ; los demás están representados en gris. La localización de algunos... [Seguir leyendo]

1. Una cepa natural aislada y purificada 05.115 de virus chikungunya (CHIKV) capaz de infectar in vitro células humanas, y donde su genoma consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4.

2. Un polinucleótido aislado y purificado que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4.

3. Un fragmento del polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E2.

4. Un fragmento del polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para una forma soluble de la glicoproteína E2.

5. Un fragmento del polinucleótido según la reivindicación 2, que codifica para el ectodominio de la glicoproteína E1.

6. Un vector que comprende un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Una célula hospedante que comprende un vector como el definido en la reivindicación 6.

8. Un polipéptido purificado codificado por un fragmento de polinucleótido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

9. Un polipéptido purificado que consiste en la secuencia definida en la Figura 40.

10. El uso de un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que consiste en el genoma definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6; -una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9; y -anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos de los mismos, que se unan específicamente a un

polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9; para la detección in vitro de un CHIKV asociado a una arbovirosis.

11. El uso de un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que comprende un genoma como el definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6; -una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; y -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9;

para la preparación de una composición que prevenga y/o trate una arbovirosis.

12. Una composición que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que comprende un genoma como el definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6; -una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; y -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, y que además comprende un

vehículo aceptable.

13. Un kit para la detección de un CHIKV asociado a una arbovirosis, que comprende al menos un paquete que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: -una cepa de virus chikungunya 05.115 que consiste en el genoma definido en la Figura 4; -un polinucleótido que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 4; -un fragmento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; -un vector como el definido en la reivindicación 6;

- una célula hospedante como la definida en la reivindicación 7; -un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9; y anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos de los mismos, que se unan específicamente a un polipéptido como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.

FIGURA 14

FIGURA 15 FIGURA 16

FIGURA 17 FIGURA 18

FIGURA 19

FIGURA 20 FIGURA 22

FIGURA 23 FIGURA 25

FIGURA 39 FIGURA 41 FIGURA 43