NUEVA PARTÍCULA RECOMBINANTE SIMILAR AL VIRUS DE LA HEPATITIS C HUMANO Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR LA MISMA.

Un procedimiento para producir una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C que comprende,

introducirla en

(i) una célula portadora de un replicón de ARN subgenómico que no incluye genes que codifican las proteínas estructurales del virus de la hepatitis C y que comprende una secuencia nucleotídica que comprende la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica codificante para la proteína no estructural, y la región no traducida 3' de un ARN genómico obtenido a partir de una cepa del virus de la hepatitis C del genotipo 1b que es una cepa con1 o una cepa obtenida a partir del mismo en la que las proteínas no estructurales son las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B

(ii) un vector del virus vaccinia o un promotor EF-1α portador del vector que expresa las proteínas Core, E1, E2 y p7 obtenidas a partir de al menos una cepa de virus seleccionada entre el grupo que consiste en cepas del virus de la hepatitis C del genotipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b que es diferente de la cepa del virus de la hepatitis C que se ha definido en (i) cultivar la célula y recuperar la partícula similar al virus producida.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2006/319573.

Solicitante: JAPAN AS REPRESENTED BY THE DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 23-1, Toyama 1-chome Shinjuku-ku Tokyo 162-8640 JAPON.

Inventor/es: MIYAMURA, TATSUO, TANABE,JUN-ICHI, SONE,SABURO, WAKITA,TAKAJI, ISHII,KOJI, SUZUKI,RYOSUKE, SUZUKI,Tetsuro.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/09 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N7/00 C12N […] › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
  • C12N7/04 C12N […] › C12N 7/00 Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00). › Inactivación o atenuación; Producción de partes elementales de virus.

PDF original: ES-2376354_T3.pdf

 

NUEVA PARTÍCULA RECOMBINANTE SIMILAR AL VIRUS DE LA HEPATITIS C HUMANO Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR LA MISMA.

Fragmento de la descripción:

Nueva partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C humano y procedimiento para producir la misma Campo técnico La presente invención se refiere a una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C humano y un procedimiento para producir el mismo.

Técnica antecedente Los productos para introducir un gen en una célula animal se clasifican en líneas generales en procedimiento fisioquímicos y procedimientos biológicos. Los ejemplos de procedimientos fisioquímicos incluyen procedimientos tales como coprecipitación con fosfato cálcico, DEAE dextrano, lipofección, microinyección y electroporación. Los ejemplos de procedimientos biológicos incluyen procedimientos que usan vectores virales.

Un procedimiento de vector viral es un procedimiento en el que un gen se introduce utilizando el mecanismo de invasión celular de un virus, es decir, la capacidad de infección.

Las proteínas estructurales derivadas de virus (nucleocápside, proteína de envoltura, etc.) existen sobre la superficie de una partícula vírica recombinante preparada usando un vector viral, que tiene un mecanismo para la introducción eficaz de un gen de forma que el virus pueda infectar una célula a través de un receptor sobre la superficie celular. Por lo tanto, una partícula recombinante viral preparada usando un vector viral de este tipo puede usarse no solo para introducir un gen en una célula animal, para generar una célula que expresa el gen de interés, sino también para realizar la terapia génica, construir un animal transgénico, y así sucesivamente.

Los vectores virales se agrupan en vectores retrovíricos, vectores de virus de ADN y vectores de virus de ARN, y se caracterizan por la longitud de un gen que puede introducirse, si el gen se incorpora en el genoma cromosómico en una célula, o si el gen se introduce únicamente a una célula de división o puede también introducirse en una célula no divisible, los tipos de células que pueden infectarse, la citotoxicidad, la eficacia de la introducción génica, y así sucesivamente, que dependen del tipo del virus original.

Los retrovirus tienen un ARN de hebra positiva como genoma. Este ARN tiene propiedades características a ARNm de células eucariotas, específicamente, una estructura casquete metilada en el extremo 5' y una cola de poliA de aproximadamente 200 nucleótidos en el extremo 3'. En una célula infectada, este ARN se convierte en ADN por transcriptasa inversa del virus. Además, el ADN se incorpora en el ADN genómico del huésped por las acciones de las enzimas codificadas por los genes virales. El ADN incorporado se denomina provirus. Aparece una secuencia repetitiva (repetición terminal larga: LTR) en cualquier extremo de un provirus, y se sintetiza ARN viral por un promotor existente en esta secuencia. Las proteínas virales se trasladan del ARN sintetizado, y se incorpora un ARN del tamaño del genoma en la partícula vírica, que se libera fuera de la célula como una partícula hija.

La estructura de ARN requerida para la producción de una partícula vírica incluye LTR en cualquier extremo, un sitio de unión al cebador intercalado entre las mismas, una señal de encapsidación y una señal de polipurina. Estos son factores cis esenciales. Por otra parte, los genes que codifican las proteínas virales no son esenciales como factores cis, y la replicación y la producción de una partícula normalmente ocurren una vez que las proteínas virales se suministran en la célula infectada.

Por lo tanto, para producir retrovirus recombinantes, se prepara un vector a partir del cual los genes codificados por el retrovirus, tales como gag, pol y env, se eliminan y en el que se inserta en su lugar un gen de interés que se va a expresar (denominado vector retrovírico) , y este vector se introduce en una célula en la que se suministran proteínas virales (denominadas normalmente como una célula empaquetadora) para preparar una partícula retrovírica incorporada con un gen extraño (Documento que no corresponde a una patente 1) .

Los ejemplos de retrovirus incluyen virus de la leucemia de ratón, virus de la leucemia felina, oncovirus tipo C del babuino, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la leucemia de linfocitos T del adulto, y así sucesivamente. Además, los ejemplos de los indicados como vectores recombinantes retrovíricos incluyeron los basados en el virus de la leucemia de ratón (Documento que no corresponde a una patente 1) , los basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (Documento que no corresponde a una patente 2) , y así sucesivamente.

Un sistema para la producción de un retrovirus recombinante consiste en dos unidades de componentes, específicamente, un vector retrovírico portador de la información genética (un gen extraño de interés) que se va a introducir y todos los factores requeridos para el empaquetamiento y la incorporación del genoma viral en cis (ADN recombinante retrovírico) y una célula empaquetadora de retrovirus que suministra proteínas víricas codificadas por los genes gag, pol y env. La partícula retrovírica recombinante no puede liberarse por una célula empaquetadora en solitario en la que se introduce un vector recombinante que expresa los genes gag, pol y env.

Para producir una partícula retrovírica recombinante, las proteínas gag, pol y env han de situarse en trans. Por lo tanto, introduciendo un vector retrovírico en una célula empaquetadora en la que se introduce un vector recombinante que expresa los genes gag, pol y env, puede producirse un retrovirus recombinante portador de la información genética mantenido en el vector que se ha mencionado anteriormente. Posteriormente, cuando una célula se infecta con estos virus, el vector retrovírico se incorporará al genoma cromosomal en la célula de acuerdo con el ciclo vital del retrovirus natural.

Por lo tanto, el procedimiento del vector retrovírico es un sistema construido con el fin de incorporar de forma eficaz un ADN específico en el genoma cromosomal del huésped. Sin embargo, ya que la ubicación del gen de interés que se va a insertar puede no predecirse, no pueden descartarse las posibilidades de que el gen normal pueda dañarse por la inserción, los genes en la proximidad del sitio de inserción puedan activarse, y el gen extraño de interés pueda sobreexpresarse o bajoexpresarse. Para superar estos problemas, se promovió el desarrollo de un sistema de expresión transitorio que usaba un vector vírico de ADN que podía utilizarse como un gen extracromosómico.

Un vector del virus de ADN es un vector obtenido a partir de un virus de ADN. El virus de ADN lleva ADN en su partícula vírica como información genética. Este ADN se replica por la repetición de un procedimiento de producción de una hebra complementaria usando su propio ADN como plantilla por enzimas de replicación de ADN dependientes de ADN obtenido del huésped al menos como parte de los catalizadores. Los ejemplos de vectores del virus de ADN que pueden utilizarse como un gen extracromosómico incluyen vectores adenovirales.

Un adenovirus humano tiene ADN de doble hebra lineal con aproximadamente 36 kb como genoma, y las regiones incluidas en este genoma se dividen a grandes rasgos en los genes tempranos E1, E2, E3 y E4 y los genes tardíos L1, L2, L3, L4 y L5. Los genes tempranos están implicados principalmente en la replicación del virus, y los genes tardíos están implicados en la síntesis de proteínas estructurales víricas, tales como una cápside. Un vector adenovírico usado para la introducción de un gen se prepara reemplazando la región E1 (dividida en E1A y E1B, y todos los promotores adenovíricos se activan por E1A) , un gen temprano, por un gen extraño deseado (gen de interés) y se prolifera usando 293 células, una línea celular que puede suministrar E1A en trans (293 células expresan E1A) . Un vector de adenovirus deficiente en la región E1A no puede proliferar en una célula normal, lo que no expresa E1A. Ya que la región E3 no es esencial para la propagación del virus, a menudo se elimina para aumentar el tamaño de inserción de un gen extraño. Ya que los adenovirus pueden empaquetar un genoma hasta el 105% del tamaño del genoma de un tipo natural en su cápside, puede insertarse un gen extraño de hasta 8, 1 kb mediante la deleción de las regiones E1 y E3 (Documento que no corresponde a una patente 3) .

Un vector adenovírico puede introducir un gen en una célula no creciente o una célula de crecimiento (Documento que no corresponde a una patente 4) . Por lo tanto, este procedimiento es adecuado para los procedimientos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para producir una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C que comprende, introducirla en

(i) una célula portadora de un replicón de ARN subgenómico que no incluye genes que codifican las proteínas estructurales del virus de la hepatitis C y que comprende una secuencia nucleotídica que comprende la región no traducida 5', la secuencia nucleotídica codificante para la proteína no estructural,

y la región no traducida 3' de un ARN genómico obtenido a partir de una cepa del virus de la hepatitis C del genotipo 1b que es una cepa con1 o una cepa obtenida a partir del mismo en la que las proteínas no estructurales son las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B

(ii) un vector del virus vaccinia o un promotor EF-1e portador del vector que expresa las proteínas Core, E1, E2 y p7 obtenidas a partir de al menos una cepa de virus seleccionada entre el grupo que consiste en cepas del virus de la hepatitis C del genotipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b que es diferente de la cepa del virus de la hepatitis C que se ha definido en (i)

cultivar la célula y recuperar la partícula similar al virus producida.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 1 a y es la cepa H77c, 1, H o HC-J1.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 1b y es la cepa J1, TH, J, JT o BK.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 2a y es la cepa JFH1, HC-J6, JCH1 o J6CF.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 3a y es la cepa NZL1, K3a/650, 452 o E-b1.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virus de la hepatitis C como se ha definido en (ii) es del genotipo 3b y es la cepa Tr.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el replicón de ARN comprende adicionalmente al menos una secuencia del sitio de entrada interno del ribosoma (IRES) y/o al menos un gen extraño.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia IRES y/o el gen extraño se sitúan entre la región no traducida 5' y la secuencia codificante de la proteína NS3.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula es una célula animal.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la célula animal es la célula Huh7, la célula HepG2, o una línea celular establecida obtenida a partir de estas células.

11. Una partícula recombinante similar al virus de la hepatitis C producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la propiedad de infectar pero no la capacidad de transmitir.

 

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