Nueva diana de péptido glucosilado en células neoplásicas.

Una glucoproteína aislada o purificada indicada como Receptor de SAM-6 (SAM-6/R),

en la que dicha glucoproteína de SAM-6/R presenta un peso molecular aparente en un intervalo de aproximadamente 80-82 kilodaltons (kDa), cuando se determina por electroforesis en gel desnaturalizante, una secuencia que comprende la SEC ID Nº: 1, presenta al menos un resto carbohidrato unido a nitrógeno (N) u oxígeno (O) distinto de Grp78, en la que un anticuerpo indicado SAM-6 se une específicamente a la glucoproteína y en la que el tratamiento de la glucoproteína de SAM-6/R con una O-glucosidasa reduce la unión del anticuerpo SAM-6 a la glucoproteína, en la que el anticuerpo SAM-6 comprende:

(a) una secuencia de la región variable de cadena pesada, en la que la secuencia de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 15 y

(b) una secuencia de la región variable de cadena ligera, en la que la secuencia de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 13.

Nueva diana de pïptido glucosilado en cïlulas neoplïsicas.

Campo de la invenciïn La invenciïn se refiere a un pïptido glucosilado o glucoproteïna que se une a un anticuerpo, conocido como SAM-6. La glucoproteïna, indicada Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R presenta aparente homologïa de secuencias/comparte identidad con la secuencia de polipïptidos de Grp78 (proteïna 78 regulada por glucosa) .

Introducciïn Hay una necesidad de mïtodos para tratar la proliferaciïn celular no deseable o anormal, tal como trastornos hiperproliferativos celulares, incluyendo neoplasias, tumores y tumores malignos. La invenciïn estudia esta necesidad y proporciona beneficios relacionados.

CANCER RESEARCH 64, 3.900-3.906, 1 de junio de 2.004 describe la muerte celular especïfica del tumor por acumulaciïn intracelular de lïpidos inducida por anticuerpos. La proteïna descrita en este documento presenta un peso molecular de 140 kDa. La patente internacional WO 2005/047332 A1 muestra un anticuerpo que, sin embargo, no presenta una secuencia de cadena pesada idïntica a la secuencia de cadena pesada como se describe en la presente memoria. Electrophoresis 1.997, 18, 605-613 describe una Proteïna GRP 78 humana identificada en un gel bidimensional de una estirpe celular LIM 1215 de carcinoma de colon humano. Esta proteïna presenta una masa molecular de 76, 0 kDa y la secuencia de aminoïcidos tiene sïlo restos de 22 aminoïcidos de largo.

Sumario La invenciïn proporciona una glucoproteïna aislada o purificada indicada como Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) , en la que dicha glucoproteïna de SAM-6/R presenta un peso molecular aparente en un intervalo de aproximadamente 8082 kilodaltons (kDa) , cuando se determina por electroforesis en gel desnaturalizante, una secuencia que comprende la SEC ID Nï: 1, presenta al menos un resto carbohidrato unido a nitrïgeno (N) u oxïgeno (O) distinto de Grp78, en la que un anticuerpo indicado SAM-6 se une especïficamente a la glucoproteïna y en la que el tratamiento de la glucoproteïna de SAM-6/R con una O-glucosidasa reduce la uniïn del anticuerpo SAM-6 a la glucoproteïna, en la que el anticuerpo SAM-6 comprende:

(a) una secuencia de la regiïn variable de cadena pesada, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoïcidos mostrada en la SEC ID Nï: 15 y

(b) una secuencia de la regiïn variable de cadena ligera, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoïcidos mostrada en la SEC ID Nï: 13.

La glucoproteïna de SAM-6/R presenta un peso molecular aparente en un intervalo de aproximadamente 80-82 kilodaltons 20 (kDa) , cuando se determina por electroforesis en gel desnaturalizante, al menos un resto carbohidrato unido a nitrïgeno (N) u oxïgeno (O) distinto de Grp78 y un anticuerpo indicado SAM-6 se une especïficamente a la glucoproteïna de SAM-6/R. En otra realizaciïn, una glucoproteïna de SAM-6/R presenta un peso molecular aparente en un intervalo de aproximadamente 80-82 kilodaltons (kDa) , cuando se determina por electroforesis en gel desnaturalizante, al menos un resto carbohidrato unido a 25 nitrïgeno (N) u oxïgeno (O) distinto de un resto carbohidrato de Grp78 y homologïa de la secuencia de polipïptidos a Grp78, como se explica en la SEC ID Nï: 1 (por ej., al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o mïs de identidad) .

En diversos aspectos, las glucoproteïnas aisladas y purificadas indicadas como Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R incluyen una secuencia de aproximadamente 655 aminoïcidos, presentan un dominio transmembrana de aproximadamente 17 aminoïcidos, presentan un dominio extracelular de aproximadamente 220 aminoïcidos o presentan un dominio intracelular de aproximadamente 411 aminoïcidos. En diversos aspectos adicionales, el Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o la glucoproteïna de SAM-6/R se caracteriza como que se expresa en una cïlula neoplïsica, cancerïgena o tumoral, por ejemplo, una estirpe celular de carcinoma de pïncreas o estirpe celular de carcinoma gïstrico, indicadas respectivamente como BXPC-3 (Depïsito ATCC Nï CRL-1687) y 23132/87 (Depïsito DSMZ Nï ACC 201) .

En otro aspecto, el resto carbohidrato unido de las glucoproteïnas aisladas y purificadas indicado como Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R se une a un resto asparagina, serina o treonina (por ej., de la SEC ID Nï: 1) . En un aspecto mïs, el anticuerpo SAM-6 se une a una porciïn de la glucoproteïna que incluye el resto carbohidrato unido a N u O o se une al resto carbohidrato unido a N u O. En aspectos adicionales, el tratamiento de Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R con una enzima glucosidasa (por ej., una O-glucosidasa o una N-glucosidasa, tal como endoglucosidasa H o endoglucosidasa F) reduce el peso molecular aparente de la glucoproteïna por aproximadamente 1-5 kilodaltons (KDa) o reduce la uniïn de anticuerpo SAM-6 al Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R. En otro aspecto mïs, el resto carbohidrato unido a N u O incluye uno o mïs de: galactosa, acetilgalactosa, manosa, fucosa, glucosa, acetilglucosa, ïcido siïlico, N

acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina.

La invenciïn proporciona ademïs secuencias de ïcidos nucleicos que codifican el Receptor de SAM-6 de la glucoproteïna (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R. En una realizaciïn, una secuencia de ïcidos nucleicos es al menos 75-90% o mïs, complementaria u homïloga a una secuencia de ïcidos nucleicos que codifica la SEC ID Nï: 1 o una subsecuencia de los mismos. En otra realizaciïn, una secuencia de ïcidos nucleicos codifica a un Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R capaz de tener unido a la misma al menos un resto carbohidrato unido a nitrïgeno (N) u oxïgeno (O) distinto de un resto carbohidrato de Grp78. En aspectos particulares, un ïcido nucleico codifica una subsecuencia de Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R. En otros aspectos, una secuencia de ïcidos nucleicos presenta una longitud de aproximadamente 10-20, 20-30, 30-50, 50100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-1.000, 1.000-2.000 nucleïtidos. En aspectos adicionales, una secuencia de ïcidos nucleicos se hibrida especïficamente a un ïcido nucleico que codifica la SEC ID Nï: 1 o una subsecuencia de los mismos o se hibrida especïficamente a una secuencia de ïcidos nucleicos complementaria a un ïcido nucleico que codifica la SEC ID Nï: 1 o una subsecuencia de los mismos. En mïs aspectos, un ïcido nucleico es un polinucleïtido antisentido, un ARN de pequeïa interferencia o un ïcido nucleico ribozima que se hibrida especïficamente a una secuencia de ïcidos nucleicos que codifica Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R y reduce la expresiïn del Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R. Los polinucleïtidos antisentido, ARN de pequeïa interferencia y polinucleïtidos ribozimas pueden presentar una longitud de aproximadamente 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300400, 400-500, 500-1.000, 1.000-2.000 nucleïtidos y ser al menos 90% complementarios u homïlogos a una secuencia de ïcidos nucleicos que codifica la SEC ID Nï: 1 o una subsecuencia de los mismos. En otros aspectos mïs, la secuencia de ïcidos nucleicos puede incluir una secuencia de control de la expresiïn o un vector (por ej., un vector vïrico, bacteriano, fïngico o de mamïfero) .

La invenciïn proporciona adicionalmente cïlulas hospedadoras transformadas con ïcido nucleico que codifica el Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R o una subsecuencia del mismo. Las cïlulas hospedadoras incluyen cïlulas eucariotas (por ej., una cïlula hiperproliferativa, cïlula inmortalizada, cïlula neoplïsica, cïlula tumoral o cïlula cancerïgena) y no eucariotas, que se pueden transformar de manera estable o de manera transitoria con el ïcido nucleico o vector.

La invenciïn, por otra parte, proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales aislados y purificados que se unen especïficamente a Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) o glucoproteïna de SAM-6/R o una subsecuencia de los mismos. El anticuerpo de la invenciïn se refiere a un anticuerpo aislado o purificado o subsecuencia del mismo que comprende:

(a) una secuencia de la regiïn variable de cadena pesada, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena pesada comprende:

(i) una secuencia de aminoïcidos que es al menos 90% idïntica a la secuencia mostrada en la SEC ID Nï: 18 y

(ii) una regiïn determinante de la complementariedad (CDR) con 100% de identidad para la CDR3 (ARDRLAVAGRPFDY) mostrada en la SEC ID Nï: 17 y

(b) una secuencia de... [Seguir leyendo]

1. Una glucoproteïna aislada o purificada indicada como Receptor de SAM-6 (SAM-6/R) , en la que dicha glucoproteïna de SAM-6/R presenta un peso molecular aparente en un intervalo de aproximadament.

8. 82 kilodaltons (kDa) , cuando se determina por electroforesis en gel desnaturalizante, una secuencia que comprende la SEC ID Nï: 1, presenta al menos un resto carbohidrato unido a nitrïgeno (N) u oxïgeno (O) distinto de Grp78, en la que un anticuerpo indicado SAM-6 se une especïficamente a la glucoproteïna y en la que el tratamiento de la glucoproteïna de SAM-6/R con una O-glucosidasa reduce la uniïn del anticuerpo SAM-6 a la glucoproteïna, en la que el anticuerpo SAM-6 comprende:

(a) una secuencia de la regiïn variable de cadena pesada, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena 10 pesada comprende la secuencia de aminoïcidos mostrada en la SEC ID Nï: 15 y

(b) una secuencia de la regiïn variable de cadena ligera, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoïcidos mostrada en la SEC ID Nï: 13.

2. La glucoproteïna aislada o purificada segïn la reivindicaciïn 1, en la que el tratamiento de la glucoproteïna de SAM-6/R con una O-glucosidasa reduce la uniïn de un anticuerpo indicado SAM-6 a la glucoproteïna.

3. La glucoproteïna segïn la reivindicaciïn 1 ï 2, en la que el resto carbohidrato se une a un resto asparagina, serina o treonina de la SEC ID Nï: 1.

4. La glucoproteïna segïn la reivindicaciïn 1 ï 2, en la que el anticuerpo SAM-6 como se definiï en la reivindicaciïn 1 se une a una porciïn de la glucoproteïna que comprende el resto carbohidrato unido a N u O o al resto carbohidrato unido a N u O.

5. La glucoproteïna segïn la reivindicaciïn 1 ï 2, en la que la glucoproteïna se caracteriza ademïs como que se expresa en una estirpe celular de carcinoma de pïncreas o estirpe celular de carcinoma gïstrico indicada respectivamente as BXPC-3 (Depïsito ATCC Nï CRL-1687) o 23132/87 (Depïsito DSMZ Nï ACC 201) .

6. Una secuencia de ïcidos nucleicos capaz de codificar la glucoproteïna segïn la reivindicaciïn 1 ï 2 o una subsecuencia de los mismos capaz de tener unidos a la misma al menos un resto carbohidrato unido a nitrïgeno (N) 25 u oxïgeno (O) distinto de un resto carbohidrato de Grp78.

7. Una secuencia de ïcidos nucleicos que se hibrida especïficamente a las secuencias de ïcidos nucleicos segïn la reivindicaciïn 6.

8. Una cïlula hospedadora transformada con el ïcido nucleico que codifica la glucoproteïna segïn la reivindicaciïn 1 ï 2.

9. Un anticuerpo aislado o purificado o subsecuencia del mismo que comprende:

(a) una secuencia de la regiïn variable de cadena pesada, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena pesada comprende:

(i) una secuencia de aminoïcidos que es al menos 90% idïntica a la secuencia mostrada en la SEC ID Nï: 18 y

(ii) una regiïn determinante de la complementariedad (CDR) con identidad del 100% para la CDR3 35 (ARDRLAVAGRPFDY) mostrada en la SEC ID Nï: 17 y

(b) una secuencia de la regiïn variable de cadena ligera, en la que la secuencia de la regiïn variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoïcidos que es al menos 90% idïntica a la secuencia mostrada en la SEC ID Nï: 13.

10. El anticuerpo aislado o purificado o subsecuencia del mismo segïn la reivindicaciïn 9, en el que las tres CDR de la regiïn variable de cadena pesada comprenden o consisten en: CDR1, SYAMH, CDR2, VISYDGSNKYYADSVKG y CDR3, ARDRLAVAGRPFDY y las tres CDR de la regiïn variable de cadena ligera comprenden o consisten en: CDR1, SGDKLGDKYAC, CDR2, QDSKRPS y CDR3, QAWDSSIVV.

11. Una composiciïn farmacïutica que comprende la glucoproteïna de SAM-6/R de las reivindicaciones 1 ï 2 o un anticuerpo o subsecuencia del mismo segïn la reivindicaciïn 9 ï 10 y un portador o excipiente farmacïuticamente 45 aceptable.

12. El anticuerpo o subsecuencia del mismo segïn cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para uso en el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo celular.

13. El anticuerpo o subsecuencia del mismo para uso segïn la reivindicaciïn 12, en el que el trastorno

hiperproliferativo celular afecta o estï presente al menos en parte en: cerebro, cabeza o cuello, mama, esïfago, 50 boca, nasofaringe, nariz o senos nasales, estïmago, duodeno, ïleon, yeyuno, pulmïn, hïgado, pïncreas, riïïn, glïndula suprarrenal, tiroides, vejiga, colon, recto, prïstata, ïtero, cïrvix, ovario, mïdula ïsea, linfa, sangre, hueso, testïculos, piel o mïsculo o sistema hematopoyïtico.

14. El anticuerpo o subsecuencia del mismo para uso segïn la reivindicaciïn 12, en el que el trastorno hiperproliferativo celular comprende una neoplasia, tumor o cïncer.

15. El anticuerpo o subsecuencia del mismo para uso segïn la reivindicaciïn 14, en el que la neoplasia, tumor o cïncer comprende un sarcoma, carcinoma, adenocarcinoma, melanoma, mieloma, blastoma, glioma, linfoma o leucemia.

16. El anticuerpo o subsecuencia del mismo para uso segïn la reivindicaciïn 15, en el que el mieloma es mieloma mïltiple.