Nueva composición de galactooligosacárido y la preparación de la misma.

Una cepa de Bifidobacterium bifidum depositada con el número de entrada NCIMB 41171 en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marítimas,

Aberdeen, Reino Unido el 31 de marzo de 2003 que produce una actividad de la enzima galactosidasa que convierte a la lactosa en una mezcla de galactooligosacáridos que comprende el disacárido Gal (beta1-6)-Gal, al menos un trisacárido seleccionado a partir de Gal (beta1-6)-Gal (beta1-4)-Glc y Gal (beta1-3)-Gal (beta1-4)-Glc, el tetrasacárido Gal (beta1-6)-Gal (beta1-6)-Gal-(beta1-4)-Glc y el pentasacárido Gal (beta1-6)-Gal (beta1-6)-Gal (beta1-6)-Gal-(beta1-4)-Glc.

Nueva composición de galactooligosacárido y la preparación de la misma.

La presente invención se refiere a nuevas cepas de Bifidobacterium bifidum que producen una nueva actividad de la enzima galactosidasa capaz de convertir la lactosa en una nueva mezcla de galactooligosacáridos. Los galactooligosacáridos son carbohidratos no digeribles, que son resistentes a las enzimas digestivas gastrointestinales de los mamíferos, pero que son fermentados por bacterias colónicas específicas. La invención también se refiere al uso de una cepa bifidobacteriana para producir una nueva composición de galactooligosacáridos que es capaz de estimular el crecimiento de bifidobacterias en el tracto intestinal. También se refiere a una nueva composición de productos de galactooligosacáridos.

La flora intestinal humana comprende géneros microbianos patógenos, benignos y beneficiosos. Un predominio de los primeros puede conducir a trastornos intestinales que pueden ser tanto agudos (por ejemplo, gastroenteritis) y crónicos (por ejemplo, la enfermedad inflamatoria del intestino, el síndrome del intestino irritable y algunos cánceres intestinales) . Se han hecho tentativas para influir en el equilibrio de la flora intestinal a favor de microorganismos beneficiosos, tales como las bifidobacterias, añadiendo una o varias de tales cepas microbianas a un vehículo de alimenticio apropiado. Tal suplemento alimenticio microbiano vivo se llama probiótico. Sin embargo, es difícil garantizar la supervivencia de bacterias vivas en los productos de alimentación y también después de la digestión.

Un enfoque alternativo a la manipulación dietética de la microflora intestinal es el uso de un prebiótico, que se define como un ingrediente alimenticio no digerible que afecta beneficiosamente al huésped estimulando selectivamente el crecimiento y/o la actividad de uno o un número limitado de bacterias en el colon, causando así una mejora de la salud del huésped.

La enorme microflora intestinal humana es adquirida en el nacimiento. El lactante alimentado con leche materna tiene una preponderancia de bifidobacterias, que compiten fácilmente con otros géneros. Esto es porque los componentes de la leche materna son estimuladores. Al contrario, el lactante alimentado con leche artificial tiene una flora más compleja que imita al tracto gastrointestinal adulto porque bacteroides, clostridia, bifidobacterias, lactobacilli, cocci gram positivo, coliformes y otros grupos están representados todos en proporciones prácticamente iguales. Las bifidobacterias generalmente son consideradas como protectores con respeto a las grandes infecciones intestinales y esta diferencia probablemente explica la mucho menor incidencia de infecciones en lactantes alimentados con el pecho comparado con los que se alimentan con leche artificial.

Ciertos componentes de la flora intestinal han sido implicados en la etiología de la enfermedad intestinal. Por ejemplo, las micobacterias se asocian a la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa puede ser provocada por bacterias reductoras de sulfato y puede haber participación bacteriana en el desarrollo del cáncer de intestino. Claramente, sería ventajoso si se pudiera potenciar el crecimiento selectivo de bacterias intestinales beneficiosas propias por la ingestión de un prebiótico. Esto tendría el efecto consiguiente de que la microflora patógena sería deprimida.

Un grupo de compuestos que es clasificado como prebióticos es el de los galactooligosacáridos, que son oligosacáridos que contienen galactosa de la forma Glc α1-4[β Gal 1-6]_n donde n=2-5, y que son producidos a partir de jarabe de lactosa usando la actividad de transgalactosilasa de la enzima β-galactosidasa (Crittenden, (1999) Probiotics: A Critical Review. Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, págs. 141-156) . Tres productos están actualmente disponibles en el comercio que tienen composiciones ligeramente diferentes. El primero de estos, los oligosacáridos transgalactosilados (TOS) , es producido usando la β-galactosidasa de Aspergillus or y zae (Tanaka et al., (1983) Bifidobacteria Microflora, 2, 17-24) , y consiste en tri-, tetra-, penta- y hexa-galacto-oligosacáridos. El segundo es Oligomate 55, que se prepara usando β-galactosidasa de A. or y zae y Streptococcus thermophilus (Ito et al., (1990) , Microbial Ecology in Health and Disease, 3, 285-292) y contiene el 36% de tri-, tetra-, penta- y hexa-galacto-oligosacáridos, 16% de disacáridos galactosil-glucosa y galactosil-galactosa, 38% de monosacáridos y 10% de lactosa. Finalmente, una preparación del disacárido transgalactosilado (TD) es producida usando la β-galactosidasa de S. thermophilus (Ito et al., (1993) , J. Nutritional Science and Vitaminolog, 39, 279-288) .

Se sabe que los miembros de las bifidobacterias producen las enzimas β-galactosidasa que están implicadas en el metabolismo bacteriano de lactosa. Moller, P. L. et al. en Appl. & Environ. Microbiol., (2001) , 62, (5) , 2276-2283 describen el aislamiento y la caracterización de tres genes de β-galactosidasa a partir de una cepa de Bifidobacterium bifidum.

La publicación de patente de EE.UU. N° US 2002/0086358 describe una nueva β-galactosidasa de Bifidobacterium bifidum, en particular una versión truncada de la enzima que tiene una alta actividad transgalactosilante. Aunque se ha demostrado que la incubación con lactosa podría ocurrir en presencia del 0, 5-60%de lactosa, el máximo rendimiento ejemplificado del galactooligosacárido producido en reacciones de transgalactosilación fue del 44% (mg de oligosacárido producido por mg de lactosa añadida) . Además, a partir de la definición de oligosacárido en esta publicación de la patente estadounidense es evidente que el producto consiste en al menos tres moléculas de azúcar unidas.

Dumortier et al. en Carbohydrate Research, 201, (1990) , 115-123 describen la formación de oligosacáridos por una reacción de transgalactosilación durante la hidrólisis de lactosa con Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Su análisis de la estructura de la mezcla de oligosacáridos producidos mostró que los enlaces eran enlaces β- (1rightarrow3) , β- (1rightarrow6) y β- (1rightarrow4) -D-galactosilo. Dumortier sugiere que los compuestos producidos por Bifidobacterium bifidum están implicados en la adhesión de bacterias en el intestino grueso.

En la actualidad se han encontrado cepas de bifidobacterium que no sólo son capaces de producir una actividad de la enzima galactosidasa que convierte la lactosa en una mezcla de galactooligosacáridos, sino que también produce una mezcla de galactooligosacáridos que contiene hasta el 35% del disacárido galabiosa (Gal (α1-6) - Gal) . El último se conoce (véase Paton, J. C. & Paton, A. W. (1989) , Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K. A. (1989) , Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350.) porque es un antiadhesivo capaz de prevenir la adhesión de toxinas, por ejemplo, la toxina Shiga, y patógenos, tales como E. coli, a la pared del intestino.

De acuerdo con la invención se proporciona una cepa de Bifidobacterium bifidum que produce una actividad de la enzima galactosidasa que convierta la lactosa en una mezcla de galactooligosacáridos que comprende el disacárido Gal (α1-6) -Gal, al menos un trisacárido seleccionado a partir de Gal (β1-6) -Gal (β1-4) -Glc y Gal (β1-3) -Gal (β1-4) -Glc, el tetrasacárido Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal- (β1-4) -Glc y el pentasacárido Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal- (β1-4) -Glc. Preferiblemente la mezcla comprende de 20 a 35% en p/v del disacárido, de 20 a 35% en p/v del trisacárido, de 15 a 25% en p/v del tetrasacárido y del 10 al 20% en p/v del pentasacárido.

El término actividad de la enzima, como se usa en relación con la actividad de la enzima galactosidasa de la presente invención, es la actividad que es el resultado de al menos una enzima galactosidasa.

Una cepa de Bifidobacterium bifidum capaz de producir una actividad de la enzima galactosidasa que convierte la lactosa en la mezcla de galactooligosacáridos como se define anteriormente se ha depositado con el número de entrada NCIMB 41171 en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas, Aberdeen el 31 de marzo de 2003.

Una tal cepa depositada de Bifidobacterium bifidum, o su equivalente biológicamente funcional, puede ser usada para producir la mezcla de galactooligosacáridos... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de Bifidobacterium bifidum depositada con el número de entrada NCIMB 41171 en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marítimas, Aberdeen, Reino Unido el 31 de marzo de 2003 que produce una actividad de la enzima galactosidasa que convierte a la lactosa en una mezcla de galactooligosacáridos que comprende el disacárido Gal (α1-6) -Gal, al menos un trisacárido seleccionado a partir de Gal (β1-6) -Gal (β1-4) -Glc y Gal (β1-3) -Gal (β1-4) -Glc, el tetrasacárido Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal- (β1-4) -Glc y el pentasacárido Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal- (β1-4) -Glc.

2. La cepa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la mezcla de galactooligosacáridos comprende del 20 al 35% en p/v del disacárido, del 20 al 35% en p/v del trisacárido, del 15 al 25% en p/v del tetrasacárido y del 10 al 20% en p/v del pentasacárido.

3. Una composición de galactooligosacáridos para estimular el crecimiento específico de bifidobacterias que comprende, como constituyentes eficaces, una mezcla que comprende el disacárido Gal (αl-6) -Gal, al menos un trisacárido seleccionado a partir de Gal (β1-6) -Gal (β1-4) -Glc y Gal (β1-3) -Gal (β1-4) -Glc, el tetrasacárido Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal- (β1-4) -Glc y el pentasacárido Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal (β1-6) -Gal- (β1-4) -Glc.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende del 20 al 35% en p/v del disacárido, 20-35% en p/v del trisacárido, 15-25% en p/v del tetrasacárido y 10-20% en p/v del pentasacárido.

5. Una composición para mejorar la salud intestinal que comprende un cultivo de la cepa de Bifidobacterium bifidum de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en combinación con la composición de acuerdo con las reivindicaciones 3 ó 4.

6. Una composición para estimular el crecimiento de bifidobacterias de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, para uso en un método de tratamiento de un ser humano o animal mediante terapia.

7. El uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en la preparación de un medicamento para prevenir la adhesión de patógenos o toxinas producidas por patógenos a la pared intestinal.

8. El uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la preparación de un medicamento para reestablecer una flora intestinal normal después del tratamiento con antibióticos o cirugía.

9. El uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en la preparación de un medicamento para tratar trastornos intestinales, por ejemplo, la enfermedad inflamatoria del intestino o el síndrome del intestino irritable.

10. El uso de una cepa de Bifidobacterium bifidum de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para producir la mezcla de galactooligosacáridos que se define en la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mezcla de galactooligosacáridos es parte de un producto para mejorar la salud intestinal.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el producto es seleccionado a partir del grupo que consiste en productos lácteos, bebidas, productos de alimentación infantil, cereales, bizcochos, repostería, tortas, suplementos alimenticios, suplementos dietéticos, piensos, alimentación de volatería o cualquier otro alimento o bebida.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el producto lácteo es seleccionado a partir del grupo que consiste en leche líquida, leche en polvo, leche entera en polvo, leche desnatada en polvo, leche en polvo con grasa añadida, polvo de suero, leche para bebés, helado, yogur, queso y productos lácteos fermentados.

14. Un método para la fabricación de una sustancia para estimular el crecimiento de bifidobacterias caracterizado porque la lactosa o un material que contiene lactosa es tratado con una cepa de Bifidobacterium bifidum de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el material que contiene lactosa es seleccionado a partir del grupo que consiste en lactosa disponible en el comercio, leche entera, leche semidesnatada, leche desnatada, suero y leche con grasa añadida.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la leche es obtenida a partir de ganado, búfalos, ovejas o cabras.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que después de la eliminación de las células de Bifidobacterium bifidum la sustancia se seca por pulverización para producir un polvo.