Nueva actividad fructofuranosidasa de Rhodotorula para la obtención de oligosacáridos prebióticos.

Se proporciona un procedimiento viable industrialmente de obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales, que utiliza una nueva enzima fructofuranosidasa de Rhodotorula. También se proporciona un procedimiento de obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, así como de la enzima sustancialmente pura con esta actividad

Nueva actividad fructofuranosidasa de Rhodotorula para la obtención de oligosacáridos prebióticos.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica y, en particular, en el sector agroalimentario dedicado a la obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales. También se relaciona con el campo de la industria farmacéutica y cosmética.

Estado de la técnica

Los hidratos de carbono, el material biológico más abundante en la naturaleza, se utilizan como elementos de partida en una gran variedad de procesos industriales; por ello, las enzimas implicadas en su metabolismo tienen un enorme interés, tanto desde un punto de vista básico como tecnológico.

El campo de los oligosacáridos prebióticos como ingredientes funcionales en alimentación se ha desarrollado de manera espectacular en los últimos años. El término prebiótico fue introducido por Gibson y Roberfroid, quienes definieron a los prebióticos como ingredientes no digeribles de los alimentos que afectan beneficiosamente al huésped por una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de una o un limitado grupo de bacterias en el colon. Las moléculas prebióticos líderes en el mercado europeo son los fructooligosacáridos (FOS) (P. T. Sangeetha, M.N. Armes, S. G. Prapulla, ``Recent trends in the microbial production, analysis and application of fructooligosaccharides, Trends Food Sci. Technol. 2005, vol. 16, pp. 442-457). Existen 3 tipos de fructooligosacáridos descritos hasta la fecha. Los más conocidos (serie ¹F) son los que se comercializan actualmente, y están formados por moléculas de fructosa unidas por enlaces ß,2-1, con una molécula de glucosa en un extremo (J.W. Yun, "Fructooligosaccharides: Ocurrence, preparation and application" Enzyme Microb. Technol. 1996, vol. 19, pp. 107-117), abreviándose como GF_n, estando n típicamente comprendido entre 2 y 4 (kestosa, nistosa y fructosilnistosa). En los fructooligosacáridos del segundo tipo (serie ⁶F), las moléculas de fructosa se encuentran unidas por enlaces ß,2-6, con una molécula de glucosa en el extremo no reductor. Normalmente estos FOS están presentes en la naturaleza en forma de polímeros de alto peso molecular (levanos). La neokestosa, trisacárido en el que una fructosa se encuentra unida por un enlace ß,2-6 a la unidad de glucosa en la sacarosa, es el primer representante de la serie ⁶G (tercer tipo de FOS). Los tres tipos de FOS, resisten la digestión en la parte superior del tracto intestinal, y se metabolizan por las bacterias endógenas del colon. Se ha demostrado que poseen la capacidad de estimular el crecimiento de las bifidobacterias (A. V. Rao, "Dose-response effects of inulin and oligofructose on intestinal bifidogenic effects" J. Nutr. 1998, vol. 80, pp.1442S-1445S). Los efectos de los FOS sobre la persona que los consume pueden ser muy variados: reducción de los episodios de diarreas causadas por rotavirus; mejora de los síntomas de la intolerancia a la lactosa; control del estreñimiento por aumento de la masa fecal; aumento de la absorción de calcio, y en consecuencia una reducción del riesgo de osteoporosis; disminución de la capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como la nitro-reductasa, asociadas con el cáncer de colon; posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias, etc.

Los FOS pueden obtenerse por hidrólisis parcial de polisacáridos naturales (inulina, levano, etc.) o por síntesis enzimática a partir de sacarosa. El perfil de productos (esp. en cuanto al grado de polimerización medio) que se genera por ambas metodologías es notablemente distinto, lo que repercute en sus propiedades.

Se ha descrito la producción de fructooligosacáridos de la serie ¹F por vía hidrolítica a partir de inulina o por vía sintética mediante el empleo de sacarosa 1-fructosiltransferasas (EC 2.4.1.9.), beta-fructofuranosidasas -invertasas- (EC 3.2.1.26) e incluso por levansacarasas (EC 2.4.1.10) (L.E. Trujillo et al., "Fructo-oligosaccharides production by thr Gluconacetobacter diazotrophicus levansucrase expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris"; Enzyme Microb. Technol. 2001, vol. 28, pp. 139-144). Empleando algunas beta-fructofuranosidasas el rendimiento de síntesis que se alcanza no representa más del 4% del total de carbohidratos de la mezcla, mientras que con 1-fructosiltransferasas el rendimiento que se puede llegar a alcanzar es mucho mayor (en torno al 50-60% referido al peso total de azúcares) (M. Antosova, M. Polakovic, "Fructosyltransferases: the enzymes catalyzing production of fructooligosaccharides" Chem. Pap. 2001, vol. 55, pp. 350-358). En la actualidad, los FOS de la serie ¹F se producen industrialmente utilizando, una beta-fructofuranosidasa de Aspergillus niger para generar oligosacáridos de cadena corta, de 3-5 unidades (C. Vannieeuwenburgh et al., "Kinetic studies and mathematical model for sucrose conversion by Aspergillus niger fructosyl-transferase under high hydrostatic pressure", Bioprocess Biosyst Eng. 2002, vol. 25, pp. 13-20). Otras enzimas con actividad fructosiltransferasa han sido descritas en hongos como Aureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae o Aspergillus japonicus (C. S. Chien et al., "Immobilization of Aspergillus japonicus by entrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides". Enzyme Microb. Technol. 2001, vol. 29, pp. 252-257).

Los fructooligosacáridos de bajo peso molecular de la serie ⁶F se obtienen mediante hidrólisis ácida a partir del polímero levano. Por vía sintética, tan solo se ha descrito la formación de FOS de la serie ⁶F con la beta-fructofuranosidasa de Schwanniomyces occidentalis (también Debaryomyces occidentalis) (M Fernández Lobato y col., "Nueva actividad fructofuranosidasa para la obtención del oligosacárido prebiótico 6-kestosa", Patente ES-P200503195, UAM-CSIC), con la invertasa de Saccharomyces cerevisiae (S. Farine, et al.. Application of high performance anion exchange chromatography to study invertase-catalysed hydrolysis of sucrose and formation of intermediate fructan products. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, vol. 55, pp. 55-60), y como producto minoritario en la formación de 1-kestosa a partir de la levansacarasa de Zymomonas mobilis (M. Bekers et al., o "Fructooligosaccharide and levan producing activity of Zymomonas mobilis extracellular levansucrase", Process Biochem. 2002, vol. 38, 701-706). En los trabajos referidos hasta ahora en la bibliografía, para la producción de fructooligosacáridos de la serie ⁶G, se emplean células completas de la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous (también llamada Phaffia rhodozyma) o de diversos hongos (p. ej. Penicillium citrinum, células inmovilizadas) (Lee et al., "Reaction route for enzymatic production of neofructo-oligosaccharides from sucrose using Penicillium citrinum cells", J. Microbiol. 2001, vol. 39, pp. 331-333; Park et al., "Continuous production of neo-fructooligosaccharides by immobilization of whole cells of Penicillium citrinum", Biotechnol. Lett. 2005, vol. 27, pp. 127-130). Se ha patentado una fructofuranosidasa extracelular de X. dendrorhous con actividad transfructosilasa capaz de formar fructooligosacáridos de la serie ⁶G (en particular neokestosa) y ¹F (en particular 1-kestosa) (P200501875, UAM-CSIC Cobertura PCT (PCT-ES22006/000435), Licenciada a Genoma España).

Las Rhodotorulas son levaduras basidiomycetes de color rosado de amplia distribución en la naturaleza. Estas levaduras se caracterizan por producir grandes cantidades de lípidos de distinto tipo (USP20020142408; USP20040072311; USP20060035351) y han sido utilizadas para la producción de ácido ascórbico (USP20050260722) y enzimas de interés industrial como la D-aminoácido oxidasa (ES19960422; USP 5877013). En Rhodotorula glutinis se ha descrito una invertasa homodimérica que solamente es secretada cuando el medio esta suplementado con sacarosa o rafinosa y cuya producción está regulada por la presencia de glucosa (M. C. Rubio et al., "Invertase from a strain of Rhodotorula glutinis", Phytochemystry 2002, vol. 61, pp. 605-609). El gen que dirige la síntesis de esta enzima no está caracterizado, y no hay datos disponibles referentes a su actividad sobre distintos sustratos o sobre su capacidad fructosil- tranferasa.

Dada la importancia industrial de...

1. Procedimiento de obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, que comprende cultivar células de Rhodotorula en un medio mínimo o rico para levaduras basado en distintas fuentes de carbono (maltosa, rafinosa, sacarosa) a una temperatura comprendida entre 28 y 30ºC y un rango de agitación orbital constante comprendido entre 150 y 250 rpm.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende cultivar células de Rhodotorula en un medio para levaduras basado en maltosa, a una temperatura de 30ºC y agitación orbital constante de 235 rpm.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que además comprende el paso de recuperar el producto enzimático del medio de cultivo y/o de las células.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las células de Rhodotorula pertenecen a una cepa seleccionada del grupo que consiste en R. mucilaginosa (CECT 10044, CECT 10059, CECT 10087, CECT 10291 y CECT 10359), R. gracilis ATCC 1416 y R. rubra ATCC 90687.

5. Producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Producto enzimático según la reivindicación 5, caracterizado porque la actividad fructofuranosidasa tiene baja especificidad de sustrato, actuando sobre sacarosa, 1-kestosa, nistosa, palatinosa, turanosa y leucrosa.

7. Producto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque no tiene actividad fructofuranosidasa sobre lactosa, maltosa y maltotriosa.

8. Producto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde la actividad fructofuranosidasa presenta un máximo en el intervalo de pH entre 4.5 y 5.5 a 42ºC, y en un intervalo de temperatura de 40 a 60ºC.

9. Producto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado porque tiene actividad fuctosiltransferasa en presencia de uno o varios sustratos glucídicos.

10. Producto enzimático según la reivindicación 9, caracterizado porque los productos glucídicos son fructooligosacáridos.

11. Producto enzimático según la reivindicación 10, donde los productos resultantes de la actividad fructosiltransferasa son oligosacáridos con enlaces y ß-2,1, y ß-2,6.

12. Producto enzimático según la reivindicación 11, donde el producto resultante de la actividad transfructosilasa es básicamente la 6-kestosa.

13. Procedimiento de obtención de oligosacáridos que comprende permitir que el producto enzimático definido en cualquiera de las reivindicaciones 5-12 actúe sobre uno o varios sustratos glucídicos.

14. Procedimiento de obtención de una enzima sustancialmente pura con actividad fructofuranosidasa, a partir del producto enzimático obtenido por el procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, que comprende la etapa adicional de purificar el producto enzimático hasta obtener la enzima sustancialmente pura.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, donde las células de Rhodotorula pertenecen a una cepa seleccionada del grupo que consiste en Rhodotorula mucilaginosa (CECT 10044, CECT 10059, CECT 10087, CECT 10291 y CECT 10359), Rhodotorula gracilis ATCC 1416 y Rhodotorula rubra ATCC 90687.

16. Enzima sustancialmente pura con actividad fructofuranosidasa obtenible por el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15.

17. Enzima según la reivindicación 16, caracterizada porque la actividad fructofuranosidasa tiene baja especificidad de sustrato, actuando sobre sacarosa, rafinosa, 1-kestosa, nistosa, palatinosa, turanosa y leucrosa.

18. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, caracterizada porque no tiene actividad fructofuranosidasa sobre lactosa, maltosa y maltotriosa,

19. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde la actividad fructofuranosidasa presenta un máximo en el intervalo de pH entre 4.5 y 5.5 a 42ºC, y en un intervalo de temperatura entre 40 y 60ºC.

20. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, caracterizada porque tiene actividad fructosiltransferasa en presencia de uno o varios sustratos glucídicos.

21. Enzima según la reivindicación 20, caracterizada porque los productos glucídicos son fructooligosacáridos.

22. Enzima según la reivindicación 21, donde los productos resultantes de la actividad fructosiltransferasa son oligosacáridos con enlaces ß-2,1, y ß-2,6.

23. Enzima según la reivindicación 22, donde los productos resultantes de la actividad fructosiltransferasa son básicamente 6-kestosa, neokestosa y 1-kestosa.

24. Enzima según cualquiera de las reivindicaciones 16-23, caracterizada por tener un peso molecular en condiciones desnaturalizantes de 172 kDa.

25. Procedimiento de obtención de oligosacáridos que comprende permitir que la enzima definida en cualquiera de las reivindicaciones 16-24 actúe sobre uno o varios sustratos glucídicos.