Nanopartículas metálicas funcionarizadas con el neuropéptido VIP y procedimiento de preparación.

Constituye el objeto de la presente invención nanopartículas metálicas funcionalizadas con el neuropéptido VIP, así como el procedimiento de preparación de dichas nanopartículas.

Las nanopartículas objeto de la presente invención presentan uniones selectivas de nanopartículas a péptidos en dos orientaciones posibles, grupo NH{sub,2} o grupo COOH. En esta última orientación, los péptidos si son reconocidos por los receptores de membranas celulares, lo que proporciona una herramienta que permite discernir efectos dependientes e independientes de receptor.

El péptido empleado ha sido el VIP, mediante el cual se obtiene un amplio espectro de funciones biológicas, incluida inmunomodulación, actuando predominantemente como un potente anti-inflamatorio y un agente inhibidor de la respuesta del Th1 en el sistema inmunitario y emergiendo como un importante factor terapéutico para el tratamientode enfermedades con componentes inflamatorias y autoinmunes

Nanopartículas metálicas funcionalizadas con el neuropéptido VIP y procedimiento de preparación.

Sector y objeto de la invención

Sector químico, bioquímico, inmunológico. Producto para aplicaciones biomédicas. Liberación de fármacos de forma selectiva e identificación de tejidos y/o células diana.

Constituye el objeto de la presente invención nanopartículas metálicas funcionalizadas con el neuropéptido VIP, así como el procedimiento de preparación de dichas nanopartículas.

Estado de la técnica

Durante las últimas décadas, se ha progresado mucho en el diseño de biosensores ópticos y su aplicación a medioambiente [Ji, J.; Schanzle, J. A.; Tabacco, M. B. Anal. Chem. (2004), 76, 1411-1418.], biotecnología [Koh1s, O.; Scheper, T. Sens. Actuators, B (2000), 70, 121-130.], diagnóstico médico [Yonzon, C. R.; Haynes, C. L.; Zhang, X.; Walsh, J. T.; Van Duyne, R. P. Anal. Chem. (2004), 76, 78-85], selección de fármacos [Ho, H.; Leclerc, M. J. Am. Chem. Soc. (2004), 126, 1384-1387.] y seguridad alimentaria [Wiskur, S. L.; Anslyn, E. V. J. Am. Chem. Soc. (2001), 123, 10109-10110.].

El potencial de los biosensores basados en resonancias de plasmones de superficie se descubrió a principios de los 80s por Liedberg et al., quienes detectaron mediante el uso de anticuerpos interacciones proteína-carbohidrato [MacKenzie, C. R.; Hirama, T.; Deng, S. j.; Bundle, D. R.; Narang, S. R. J. Biol. Chem. (1996), 271, 1527-1533.], proteína-ADN [Brockman, J. M.; Frutos, A. G.; Corn, R. M. J. Am. Chem. Soc. (1999), 121, 8044-8051.], ADN-ADN [Gotoh, M.; Hasegawa, Y.; Shinohara, Y.; Shimizu, M.; Tosu, M. DNA Res. (1995), 2, 285-293.] y adhesión de células [Van Der Merwe, P. A.; Barclay, A. N. Curr. Opin. Immunol. (1996), 8, 257-261].

El primer biosensor de anticuerpos basado en la respuesta de la extinción de nanopartículas de Au coloidales a perturbaciones locales del índice de refracción, se desarrolló hace menos de una década [Englebienne, P. Analyst (1998), 123, 1599-1603.]. Desde entonces, los biodetectores basados en las resonancias de plasmones localizados en superficie (LSPR) de nanopartículas se han empleado de forma creciente en detecciones biológicas [Haes, A. J.; Van Duyne, R. P. J. Am. Chem. Soc. (2002), 124, 10596-10604; C. R. Yonzon, E. Jeoung, S. Zou, G. C. Schatz, M. Mwksich, R. P. Van Duyne J. Am Chem. Soc. (2004), 126, 12669] y químicas [McFarland, A. D.; Van Duyne, R. P. Nano Lett. (2003), 3, 1057-1062.].

Gracias al enorme interés de esos nano-bioconjugados se han desarrollado un amplio rango de aplicaciones tales como distribución de fármacos, marcadores moleculares, análisis bioquímicos ultrasensibles, desarrollo de dispositivos "lab-on-a-chip", construcción de nanocomponentes electrónicos, motores nano-moleculares... etc [C. M. Niemeyer, C. A. Mirkin Eds. Nanobiotechnology, Wiley-VCH 2004].

También se han usado como agentes potenciadores de contraste en microscopía electrónica [D. L. Feldheim, C. A. Foss, Jr. Eds. Metal nanoparticles. Synthesis, Characterization and Applications, Marcel-Dekker 2002.].

Existe un creciente interés por los efectos biológicos de las nanopartículas, de su toxicidad y su alcance en función del medio [M. Tsoli et al. Small (2005); 1:841], por ejemplo, su uso potencial como herramienta terapéutica en tratamientos de : cáncer [Ivan H. El-Sayed, Xiaohua Huang and Mostafa A. El- Sayed. Nano Letters (2005) Vol.5, N°5. 829-834].

Entre los diferentes tipos de nanopartículas, los metales nobles son de especial relevancia pues gracias a sus propiedades plasmónicas se produce un aumento de la señal, mejorando la sensibilidad de la técnica y haciéndolos idóneos como marcadores moleculares en medidas de transmisión y dispersión de luz [M.A. El-Sayed Acc. Chem. Res. (2001), 34, 257.], SERS [M. Käll, H. Xu, P. Johansson, Journal of Raman Spectroscopy, (2005), 36, 510.], infrarrojo (IR) y fluorescencia [S. Schultz, D.R. Smith, J.J.Mock, D.A.Schultz P.N.A.S. (2000), 97, 996].

Por otro lado, los efectos biológicos del neuropéptido VIP tienen un interés creciente por su capacidad moduladora en patologías en las que hay un componente inflamatorio y/o autoinmunitario [Grimm, M. C. et al. (2003) J. Immunol. 171, 4990-4994; Pozo, D. (2003) Trends Mol. Med. 9, 211-217; Ganea, D., and Delgado, M. (2002). Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 13, 229-237; Delgado, M. et al. (2003). Trends Immunol. 24, 221-224]. Asimismo las células de determinados tumores humanos sobreexpresan receptores específicos para VIP en sus membranas plasmáticas. Su toxicidad y efectos adversos son escasos. Sin embargo, una de las limitaciones para el uso clínico de los neuropéptidos en general, y del VIP en particular, es su corta vida media en circulación, lo que haría necesaria la administración crónica del mismo, aumentando los costes económicos y dificultando su posología al paciente.

La funcionalización de nanopartículas se sabe que aumenta en determinados casos la vida media de la molécula unida a la misma, ya que dificulta el ataque proteolítico. En cualquier caso, ya sea como agente terapéutico sobre células dianas o como modo de liberación de otros fármacos sobre tumores que sobreexpresan receptores de VIP, la funcionalización de nanopartículas de VIP se enfrenta al problema de diseñar un método eficaz por el que se pueda funcionalizar de forma que su extremo carboxilo-terminal quede libre, ya que es por éste extremo por donde interacciona con sus receptores específicos de membrana. En general, la funcionalización de un péptido para dejar libre su extremo aminoterminal no presenta dificultades en la actualidad, justo lo opuesto a lo que ocurre cuando se pretende dejar expuesto el extremo carboxilo.

El procedimiento objeto de la presente invención permite la funcionalización de VIP en nanopartículas metálicas dejando intacta su capacidad de interacción con sus receptores específicos, lo que permitirá formular estrategias de detección y liberación selectiva de fármacos sobre células tumorales o el tratamiento de enfermedades con un componente autoinmune y/o inflamatorio.

En resumen, los estudios hasta la fecha descritos mantienen una orientación de nanopartícula/péptido dejando libre el grupo amino de la proteína para participar en las funciones de reconocimiento celular. En las nanopartículas objeto de la presente invención, una de las configuraciones deja libre el grupo amino, mientras que otra permite dejar el extremo ácido del VIP disponible, el grupo funcional realmente encargado de mantener esa recepción específica e intervenir en las funciones celulares. Las nanopartículas así funcionalizadas son estables, no tóxicas, solubles en agua, y compatibles con los sistemas biológicos. Permiten asimismo el estudio y adscripción de efectos dependientes (carboxilo libre) e independientes de receptor (amino libre).

En cuanto al procedimiento de preparación, no hay técnica actual sobre la funcionalización de nanopartículas con proteínas que tengan libre su extremo ácido. Gracias al procedimiento objeto de la presente invención, se obtienen aquí nanopartículas funcionalizadas con péptidos, que gracias a tener su grupo ácido disponible, pueden participar en otras funciones de reconocimiento celular.

Para que el VIP [Grimm, M. C. et al. (2003) J. Immunol. 171, 4990-4994; Pozo, D. (2003) Trends Mol. Med. 9, 211-217; M; Ganea, D., and Delgado, M. (2002). Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 13, 229-237; Delgado, M. et al. (2003). Trends Immunol. 24, 221-224; D. Pozo, M. Delgado. FASEB Journal. (2004); 18: 1325] sea reconocido a nivel celular, necesita de esta segunda orientación (grupo ácido disponible) y así poder transducir éstas funciones de reconocimiento celular en una respuesta biológica.

Por tanto, el procedimiento objeto de la presente invención permite sintetizar nanopartículas que puedan ser usadas como sensores distintos grupos orgánicos y más específicamente nanopartículas con proteínas con grupos ácidos disponibles que puedan intervenir en funciones de reconocimiento celular.

Explicación de la invención

Constituye un objeto de la presente invención las nanopartículas metálicas funcionalizadas, compuestas por un núcleo metálico unido a un mercaptoderivado, el cual a su vez se une a través de al menos uno de sus grupos ácidos...

1. Nanopartículas metálicas funcionalizadas compuestas por un núcleo metálico unido un mercaptoderivado, el cual a su vez se une a través de al menos uno de sus grupos ácidos a un polímero derivado del polietilénglicol (PEG) bis-amino terminado, caracterizadas porque las nanopartículas están funcionalizadas con un neuropéptido.

2. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según la reivindicación 1, caracterizadas porque el neuropéptido es el péptido intestinal vasoactivo (VIP).

3. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque el neuropéptido se une a través de su grupo carboxilo a uno de los grupos amino del PEG bis-amino terminado, quedando el grupo amino del péptido libre para interaccionar con receptores específicos.

4. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque las nanopartículas están conjugadas con un diácido a través de uno de los grupos amino del PEG bis-amino terminado, estando dicho diácido a su vez enlazado a través de uno de los grupos ácido con el grupo amino del neuropéptido, quedando expuesto el grupo carboxilo del neuropéptido para interaccionar con receptores específicos.

5. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 1-4, caracterizadas porque el material metálico del núcleo es plata.

6. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 1-5, caracterizadas porque el mercaptoderivado es tiopronina.

7. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 5 y 6, caracterizadas porque la tiopronina y la plata se encuentran en proporción 3:1 en la nanopartícula.

8. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 4-7, caracterizadas porque el diácido es ácido succínico.

9. Nanopartículas metálicas funcionalizadas según las reivindicaciones 1-8, caracterizadas porque presentan geometría esférica y tienen un diámetro medio de 5 nm.

10. Procedimiento de preparación de nanopartículas funcionalizadas con un neuropéptido de acuerdo a las reivindicaciones 1-3 que incluye las siguientes etapas:

a) formación de nanopartículas con un núcleo de material metálico unido a un mercaptoderivado, mediante adición de una disolución del mercaptoderivado a una disolución acuosa de una sal del material metálico, posterior reducción con un agente reductor, particularmente borohidruro de sodio, precipitación de las nanopartículas formadas mediante adición de metanol y recogida por centrifugación, terminando esta etapa con un lavado de las nanopartículas precipitadas y separadas con etanol, metanol y acetona;

b) dialización frente a agua de las nanopartículas separadas en la etapa anterior, así como eliminación del disolvente utilizado para el lavado hasta conseguir una concentración inferior a 2.10^-7 moles/ml y disolución en ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 50 mM;

c) conjugación de las nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado preparadas y dializadas en las etapas anteriores con polietilénglicol bis-amino terminado, mediante adición inicial de EDC [N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida] 0,1 mM y NHS [N-hidroxisuccinimida] 0,25 mM y ulterior adición de PEG bis-amino terminado, manteniendo agitación durante 24 horas; y

d) dialización en agua de la disolución de nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado de la etapa anterior y eliminación del disolvente hasta conseguir una concentración inferior a 2.10^-7 moles/ml y disolución en MES 50 mM, estando el procedimiento caracterizado porque incluye adicionalmente las siguientes etapas: