MUTANTE DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD INFECCIOSA DE LA BURSA Y VACUNAS.

Un método para la preparación de un mu- tante del virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) clásico que expresa una proteína VP2 que se une al anticuerpo monoclonal (moab) B69 y al moab 67,

secretados por las líneas celulares de hibridomas HB-9437 y HB- 11122, respectivamente, depositadas en la ATCC, Rockville, EE.UU., que se caracteriza porque una o más mutaciones son introducidas en la región codificadora de VP2 de una cepa clásica de IBDV, de tal manera que (i) un codón para el aminoácido en posición 222 codifica serina o treonina, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para las posiciones 318-323 codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID N os 1-5

La presente invención tiene que ver con un mutante del virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) clásico y con una vacuna que contiene tal mutante del IBDV clásico.

El virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) es un miembro de la familia Birnaviridae. Los virus de esta familia tienen una organización genómica muy similar y un ciclo de replicación similar. Los genomas de estos virus constan de dos segmentos (A y B) de ARN bicatenario (ds). El segmento mayor A codifica una poliproteína que es cortada mediante autoproteolisis para formar las proteínas víricas maduras VP2, VP3 y VP4. VP2 y VP3 son las proteínas estructurales principales del virión. VP2 es el inmunógeno principal protector del huésped de los birnavirus y contiene las regiones inmunogénicas responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes del virus.

Existen dos serotipos para el IBDV, serotipos 1 y 2. Los dos serotipos pueden ser diferenciados mediante ensayos de neutralización del virus (VN). Se ha demostrado que los virus de serotipo 1 son patógenos para los pollos, mientras que los IBDV de serotipo 2 causan únicamente una enfermedad subaguda en los pavos. La enfermedad infecciosa de la bursa (IBD), denominada también enfermedad de Gumboro, es una infección vírica aguda de los pollos, muy contagiosa, que tiene como diana primaria el tejido linfoide con un tropismo selectivo para las células de la bursa de Fabricius. La tasa de morbilidad en las bandadas susceptibles es elevada, con una rápida pérdida de peso y tasas de mortalidad de moderadas a altas. Los pollos que se recuperan de la enfermedad pueden tener deficiencias inmunes debido a la destrucción de la bursa de Fabricius, que es esencial para el mecanismo de defensa de los pollos. El virus de la IBD causa una inmunosupresión grave en los pollos menores de 3 semanas de edad e induce lesiones de la bursa en los pollos de hasta 3 meses de edad.

Durante muchos años, la enfermedad pudo ser prevenida mediante la inducción de niveles elevados de anticuerpos en las bandadas reproductoras por la aplicación de una vacuna inactivada a los pollos que habían sido estimulados con una vacuna de IBDV vivos atenuados. Esto ha mantenido al mínimo las pérdidas económicas causadas por la IBD. Los anticuerpos maternos de los pollos derivados de los reproductores vacunados impiden la infección temprana con IBDV y disminuyen los problemas asociados con la inmunosupresión. Además, se han utilizado también con éxito vacunas vivas atenuadas en bandadas de pollos comerciales después de que los anticuerpos maternos hubieran declinado.

Históricamente, los virus de la IBD constaban solamente de un tipo que es conocido como virus de la IBD “clásico”. Sin embargo, a mitad de los años 80 se observó una enfermedad aguda en bandadas vacunadas con vacunas basadas en el IBDV clásico, en particular en EE.UU. Se encontró que esta enfermedad estaba causada por virus de la IBD que tenían un carácter inmunogénico diferente. Estos nuevos virus emergieron probablemente como resultado de la deriva genética. La aparición de estas cepas de IBDV denominadas “variantes” requirió el diseño de nuevos programas de vacunación contra la IBD, ya que las cepas vacuna del IBDV clásico no eran capaces de inducir una protección cruzada adecuada. Los subtipos variantes más importantes de los IBDVs de serotipo 1 identificados en el pasado fueron las variantes Delaware-E, GLS, RS/593 y DS326. Las cepas variantes pueden ser identificadas y distinguidas de las cepas clásicas mediante un ensayo de neutralización del virus, un panel de anticuerpos monoclonales o RT-PCR.

La variante Delaware-E fue descrita por Rosenberger y col. (Proc. 20th. Natl. Meet. On Poultry Health and Condemnations; Ocean City, MD, EE.UU., 94-101, 1985) y por Snyder y col. (Avian Diseases 32, 535-539, 1985). El virus GLS fue aislado en EE.UU. en 1987 y DS326 (similar a GLS) fue aislado en EE.UU. en 1988 (Snyder y col., Arch. Virol. 127, 89-101, 1992 y van Loon y col., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Alemania, 179-187, 1994). La cepa RS/593 (similar a la variante E) fue aislada también en EE.UU. en 1993 (Snyder y col., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Alemania,

15 65-70, 1994). En la técnica se utiliza comúnmente un panel de anticuerpos monoclonales (moab) neutralizantes del virus en un inmunoensayo enzimático de captura del antígeno (AC-ELISA) para identificar los diferentes tipos de IBDV.

20 El patrón de reactividad de estos moabs con las cepas de IBDV existentes está resumido en la Tabla 1 siguiente. Tabla 1: Las diferentes cepas variantes del IBDV determinadas mediante el patrón de reacción del panel de moabs

Los moabs VN R63 y B69 neutralizan las cepas

clásicas del IDBV con títulos elevados y el moab B69 se

une específicamente a las cepas clásicas. El moab BK9 se

une únicamente a las cepas variantes Delaware-E. Puede utilizarse una reacción positiva con el moab 57 para separar las cepas GLS y DS326 de la cepa clásica y de la variante Delaware. Estos y otros moabs son utilizados generalmente en el campo para distinguir entre cepas (variantes) del IBDV determinando el patrón de reacción del panel de moabs disponibles. Los hibridomas que secretan los moabs están también disponible en la ATCC (Rockville, EE.UU.) bajo los números de acceso siguientes: R63 (HB9490), 8 (HB-10174), B29 (HB-9746), BK-9 (HB-10157), 67 (HB-11122), 57 (HB-10156), B69 (HB-9437) y 179 (HB10158). Las cepas variantes del IBDV y los hibridomas están también disponible en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes del Institute Pasteur, Paris, Francia, bajo los siguientes nos de acceso: DS 326 (I910), GLS (I-792 e I-793) y moab 10 (I-2812).

Aunque se ha propuesto la importancia de algunas regiones y de aminoácidos definidos dentro de la proteína VP2 del IBDV para la variación antigénica entre las cepas del IBDV (Vakharia y col., Virus Research 31, 265-273, 1994 y Snyder y col., Avian Diseases 38, 701707, 1994), no se ha determinado todavía la presencia obligatoria de todos los aminoácidos para la formación de epítopos neutralizantes del IBDV. En Virus Research 49, 131-137, 1997, Vakharia y col. informaron que el aminoácido prolina estaba presente en la variante E del IBDV. En la solicitud de patente internacional WO 95/26196, Vakharia y col. sugirieron la implicación de los aminoácidos 286 (Ile), 318 (Asp) y 323 (Glu) en el contexto de la unión de la proteína VP2 de una variante E con el moab

67. Además, se describen múltiples diferencias entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas VP2 del IBDV clásico y VP2 de las variantes. Las posiciones de aminoácidos 222 (Pro), 249 (Gln) y 254 (Gly) fueron consideradas relevantes para la formación del epítopo B69 en la

proteína VP2 de GLS.

EP 1170302 (Akzo Nobel N.V.) describe la preparación de un mutante de una variante E de IBDV con una inmunogenidad mejorada frente a las cepas clásicas de IBDV. Este mutante de IBDV fue obtenido mediante la introducción de mutaciones en la región codificadora de VP2 de la variante E en los codones para los aminoácidos 253 (Gln a His), 284 (Ala a Thr), 254 (Ser a Gly) y 270 (Ala a Thr). Ninguno de estos mutante de la variante E del IBDV expresa una proteína VP2 que se una al moab B69.

Sin embargo, en la misma no se revela ninguna información que permita la generación de un mutante del IBDV clásico que exprese también un epítopo neutralizante de la variante E del virus. Tal mutante sería muy útil en vacunas para inducir protección contra la enfermedad causada por las cepas clásicas y variantes del IBDV en el campo.

En la presente invención, se ha construido un nuevo mutante del IBDV basado en un IDBV clásico mediante la introducción de mutaciones en la región codificadora de VP2, de tal manera que la proteína VP2 expresada por el virus contiene el epítopo neutralizante del virus 67 que es típico de los IBDVs variantes. Los inventores encontraron que en el contexto de la proteína VP2 clásica, la reactividad con el moab 67 está influenciada por secuencias de aminoácidos separadas por 100 aminoácidos aproximadamente. Además, la suposición realizada por Vakharia y...

1. Un método para la preparación de un mutante del virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) clásico que expresa una proteína VP2 que se une al anticuerpo monoclonal (moab) B69 y al moab 67, secretados por las líneas celulares de hibridomas HB-9437 y HB11122, respectivamente, depositadas en la ATCC, Rockville, EE.UU., que se caracteriza porque una o más mutaciones son introducidas en la región codificadora de VP2 de una cepa clásica de IBDV, de tal manera que

(i) un codón para el aminoácido en posición 222 codifica serina o treonina, y

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para las posiciones 318-323 codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID Nos 1-5.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque la mutación es introducida en el codón para el aminoácido en posición 222 en la región codificadora de VP2 de una cepa clásica del IBDV que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza porque la proteína VP2 se une también al moab R63 secretado por la línea celular de hibridomas HB-9490, depositada en la ATCC, Rockville, EE.UU.

4. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, que se caracteriza porque la región que codifica VP2 contiene un codón para el aminoácido en posición 330 que codifica arginina o serina.

5. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza porque una o más mutaciones son introducidas en la región codificadora de VP2 de la cepa D78 del IBDV.

6. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que se caracteriza porque una o más mutaciones son introducidas en un segmento A genómico de un IBDV clásico, preferiblemente de la cepa D78 del IBDV.

7. Un mutante del IBDV clásico obtenible mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que se caracteriza porque una o más mutaciones son introducidas en la región codificadora de VP2 de una cepa clásica del IBDV, de tal manera que

(i) un codón para el aminoácido en posición 222 codifica treonina, y

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para las posiciones 318-323 codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID Nos 1-5.

8. Un mutante del IBDV clásico obtenible mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que se caracteriza porque una o más mutaciones son introducidas en la región codificadora de VP2 de una cepa clásica del IBDV, de tal manera que

(i) un codón para el aminoácido en posición 222 codifica serina o treonina, y

(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para las posiciones 318-323 codifica una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEC ID Nos 2-5.

9. Un mutante del IBDV clásico de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, que se caracteriza porque la proteína VP2 se une también al moab R63, secretado por la línea celular de hibridomas HB-9490, depositada en la ATCC, Rockville, EE.UU.

10. Un mutante del IBDV clásico de acuerdo con las reivindicaciones 7 -9, que se caracteriza porque la región codificadora contiene un codón para el aminoácido en posición 330 que codifica arginina o serina.

11. Un mutante del IBDV clásico de acuerdo con las reivindicaciones 7 -10, que se caracteriza porque el mutante contiene una o más mutaciones en la región codificadora de VP2 de la cepa D78 del IBDV.

12. Un mutante del IBDV clásico de acuerdo con las reivindicaciones 7 -11, que se caracteriza porque el mutante contiene un segmento A genómico de un IBDV clásico, preferiblemente de la cepa D78 del IBDV.

13. Una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral contra la enfermedad causada por la infección con IBDV, que se caracteriza porque la vacuna comprende un mutante del IBDV clásico de acuerdo con las reivindicaciones 7 – 12, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

14. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 13, que se caracteriza porque el mutante del IBDV clásico está en forma viva.

15. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 13 ó 14, que se caracteriza porque la vacuna contiene además uno o más componentes vacuna de otros patógenos infecciosos para las aves de corral.

16. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 13 – 15, que se caracteriza porque la vacuna contiene un adyuvante.

17. Un método para la preparación de una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral contra la enfermedad causada por la infección con IBDV, que se caracteriza porque un mutante del IBDV clásico de acuerdo con las reivindicaciones 7 – 12 es mezclado con un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable.