Mutante de tPA en el tratamiento de lesiones cerebrales agudas y trastornos neurodegenerativos.

Una composición que comprende al menos una molécula de tPA (activador del plasminógeno tisular) mutado desprovista de actividad de serínproteasa que tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE (barrera hematoencefálica),

en la que dicha molécula mutada lleva al menos una mutación puntual situada en cualquier posición de los residuos Ser481, His325, Asp374, Asp475 y Ser500 Gly502 de la molécula de tPA de tipo salvaje como se indica en la SEC ID Nº 2 o cualquier combinación de los mismos y en la que dicha composición es para su uso en el tratamiento, mejora o profilaxis de una afección patológica que implica lesión neurológica o una enfermedad o afección isquémica, dicha composición es para administración parenteral, en la que dicha administración parenteral es una cualquiera de administración intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) e intradérmica.

Muíante de tPA en el tratamiento de lesiones cerebrales agudas y trastornos neurodegenerativos Campo de la invención

La Invención se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento, mejora y prevención de afecciones que implican daño neuronal. Más particularmente, la invención se refiere a muíante de tPA desprovisto de actividad proteasa y a usos del mismo en composiciones para usar en el tratamiento y prevención de ictus, lesión cerebral aguda y trastornos neurodegenerativos.

Antecedentes de la invención

La lesión cerebral traumática (LCT) es una de las principales causas de muerte y discapacidad grave, con una incidencia estimada de 1,5 millones de casos nuevos al año en Estados Unidos, por desgracia, lo que resulta en 50.000 muertes Un total de 5,3 millones de americanos, aproximadamente el 2 % de la población estadounidense, viven actualmente con discapacidades resultantes de LCT. La activación de la coagulación dentro del sistema nervioso central (SNC) es un acontecimiento temprano y casi universal que acompaña a las LCT graves. El cerebro es rico en el factor tisular, el iniciador de la cascada de la coagulación [Goodnight, S.H. y col., N. Engl. J. Med. 290:1043 - 1047 (1974)], que se libera en respuesta a la LCT. La formación del coágulo en la circulación sistémica es evidente en cuestión de minutos y es probable que se produzca incluso antes en el sitio de la lesión [Stein, S.C. y col., J. Neurosurg.97:1373 - 1377 (2002)]. Existe una fuerte correlación entre el grado en que la coagulación se activa, el desarrollo de cambios progresivos observados en la TC, y la probabilidad de un resultado adverso, que no depende de la gravedad de la lesión por sí sola [Stein, S.C. y col., Neurosurgery 32:25 - 30;discussion 30 - 21(1993)]. De hecho, la coagulopatía grave ocupa el segundo lugar después del shock como factor predictor independiente de resultados adversos.

Los activadores del plasminógeno son enzimas que activan el plasminógeno cimógeno para generar la plasmina serínproteinasa, que degrada la fibrina. Entre los activadores del plasminógeno estudiados se encuentran estreptoquinasa, uroquinasa y el activador del plasminógeno tisular humano (tPA) y la dismutasa.

El activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA), una serínproteasa glicosilada de varios dominios, es un activador específico de fibrina de plasminógeno y un agente trombolítico muy eficaz. El tPA es una proteína cuya aplicación principal es en el tratamiento de pacientes con ataque cardíaco y accidente cerebrovascular. Se caracterizó por primera vez en 1979 como agente farmacéutico biológico importante y potente en el tratamiento de diversas enfermedades vasculares debido a su alta especificidad por la fibrina y su potente capacidad para disolver coágulos de sangre in vivo. El complejo activador plasminógeno-estreptoquinasa anisoilado de disolución de coágulos de Beechem Laboratories, de nombre comercial Eminase, se reivindica que reduce la tasa de mortalidad en las víctimas de ataque cardíaco en un 50 %. El TPA de Gene Tech (Activase) también es muy eficaz en la disolución de coágulos de sangre.

El tPA natural tiene una semlvlda en plasma de aproximadamente seis minutes o menos. Debido a su rápido aclaramiento de la circulación, el tPA tiene que prefundirse para lograr la trombolisis. La dosificación de carga frontal con concentraciones crecientes de tPA se ha mostrado una lisis más rápida y completa en comparación con el protocolo de perfusión estándar y la potencia temprana se correlaciona con una mejor tasa de supervivencia.

Activadores del plasminógeno y TBI

La existencia continua de los coágulos de fibrina está regulada no solo por la exposición del factor tisular, sino también por el sistema fibrinolítico. La fibrina es Usada por la plasmina. La plasmina se forma a partir de la proenzima plasminógeno a través de la escisión de un solo enlace peptídlco, principalmente por el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) o de tipo uroquinasa (uPA). La actividad de la plasmina está restringida por la formación de complejos enzlmátlcamente Inactivos con el inhibidor circulante cfe-antiplasmina, mientras que el tPA y el uPA están regulados de una manera similar mediante la formación de complejos con el inhibidor 1 del activador del plasminógeno-1 (PAI-1). Estos complejos se eliminan rápidamente de la circulación a través de la proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP).

Los ratones transgénicos deficientes en tPA endógeno (tPA'/_) tienen propensión a acumular fibrina espontáneamente [Carmeliet, P. y col., Nature, 369:419 - 424 (1994)] y son menos capaces de Usar coágulos añadidos exógenamente [Carmeliet, P. y col.,(1994) Ibid.; Bdeir, K. y col., Blood, 96:1820 - 1826 (2000)]. Por otro lado, los ratones tPA - / - muestran lesiones corticales más pequeñas y menos edema después de una LCT [Morí, T. y col., Clinical Neuroscience and Neurology, 12:4117 - 4120 (2001)] y tienen lesiones más pequeñas y una mejor recuperación de la función neurológica después de una lesión medular [Abe, Y. y col., Journal of Neurotrauma, 20:43 - 57 (2003)] que los ratones SV. En modelos de accidente cerebrovascular iniciados por oclusión mecánica, el tamaño de la zona infartada en ratones tPA - / - también es menor que en los animales SV [Wang, Y. y col., Nat Med, 4:228 - 231 (1998)], mientras que en los modelos caracterizados por trombosis cerebral, la deficiencia de tPA exacerba el depósito de fibrina cerebrovascular y la lesión en el SNC [Tabrizi, P. y col., Arterioscler. Thromb. Vaso. Biol., 19:2801 - 2806 (1999)]. Estas observaciones sugieren que el tPA puede tener efectos perjudiciales sobre la

función del SNC en el contexto de una LCT, a pesar del beneficio atribuible a su actividad fibrinolítica.

Vasoactividad cerebral de tPA y sus posibles efectos neurotóxicos

Los presentes inventores han informado anteriormente de que la inyección IV de tPA disminuye la resistencia vascular cerebral en ratas y, por lo tanto, el tPA altera el tono vascular. Los inventores han encontrado previamente que las altas concentraciones (> 20 nm) de tPA estimulan la contracción de los anillos aórticos aislados y aumentan la presión arterial sistémica en ratas [Nassar, T. y col., Blood, 103:897 - 902 (2004)]. Por el contrario, el tPA en estas y todas las concentraciones analizadas indujo vasorrelajación en la circulación cerebral de cerdos y ratas. La disminución resultante de la resistencia vascular cerebral (RVC) puede estar relacionada con el desarrollo de edema cerebral, una de las complicaciones más graves del accidente cerebrovascular y la revascularización de áreas isquémicas inducidas por tPA. En apoyo de esta ¡dea se encuentra el hallazgo de que los ratones tPA - / - desarrollan menos edema cerebral después de una LCT [Morí, T. y col., (2001) Ibid.].

Receptor de NMDA en la LCT y efecto del tPA en la hemodinámica cerebral

El receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) es un receptor ionotróplco que se une al transmisor aminoacídlco excltatorio glutamina. La activación del NMDA-R provoca vasodilatación cerebral y puede representar un mecanismo que acopla el metabolismo local al flujo sanguíneo [Farad, F.B., KR. Clrculation Research. 1993,72:476 - 480 (1993)]. Se ha implicado a todos los subtipos de receptores de glutamato en la neurotoxicidad. Sin embargo, se cree que el subtipo NMDA desempeña un papel crucial en la muerte celular neuronal excitotóxica [Choi, D. Journal of Neurobiology, 23:1261 - 1276 (1992)]. La hlperactividad del sistema glutamatérgico se ha demostrado en modelos animales de LCT y los antagonistas del NMDA-R protegen contra la lesión cerebral experimental [Katayama Y, B.D. y col., Journal of Neurosurgery, 73:889 - 900 (1990); Kawamata, T.K. y col., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 12:12 - 24 (1992)]. Se ha informado que el tPA señaliza dentro del SNC mediante la escisión de la subunidad NR-1 del NMDA-R [Nicole O, D.F. y col., Nat. Med., 7:59 - 64 (2001)].

En estudios anteriores, los inventores examinaron el papel desempeñado por el receptor de glutamato NMDA (NMDA-R) en la lesión del SNC mediada por tPA después de una LCT. Los resultados de estos experimentos mostraron que el péptido derivado de PAI-1 EEIIMD (también indicado por la SEC ID N° 3) inhibe la vasoactividad mediada por el NMDA-R, incluida la posterior a una LCT.

Teniendo en cuenta que el tPA ejerce su efecto sobre el NMDA-R mediante la escisión de su subunldad NR-1, los inventores especularon que el tPA mutante que carece de la actividad catalítica puede competir con el tPA endógeno que se libera y alcanza concentraciones altas en el LCR durante la LCT. Este efecto competitivo puede reducir o incluso prevenir la neurotoxicidad... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende al menos una molécula de tPA (activador del plasmlnógeno tisular) mutado desprovista de actividad de serínproteasa que tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE (barrera hematoencefálica), en la que dicha molécula mutada lleva al menos una mutación puntual situada en cualquier posición de los residuos Ser481, His325, Asp374, Asp475 y Ser500 Gly502 de la molécula de tPA de tipo salvaje como se indica en la SEC ID N° 2 o cualquier combinación de los mismos y en la que dicha composición es para su uso en el tratamiento, mejora o profilaxis de una afección patológica que implica lesión neurológica o una enfermedad o afección isquémica, dicha composición es para administración parenteral, en la que dicha administración parenteral es una cualquiera de administración intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) e intradérmica.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula lleva una mutación puntual en Ser481 a Ala, y tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID N° 1, o un fragmento de la misma sin residuos RS de aminoácidos adicionales en N-terminal, dicho fragmento tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE (barrera hematoencefálica).

3. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una molécula de tPA mutado desprovista de actividad serínproteasa, que tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE, dicha composición comprende además un agente terapéutico adicional, en el que dicho agente terapéutico es un secuestrante glutamato y en el que dicha molécula mutada lleva al menos una mutación puntual situada en cualquier posición de los residuos Ser481, His325, Asp374, Asp475 y Ser500 Gly502 de la molécula de tPA de tipo salvaje como se indican en la SEC ID N° 2 o cualquiera de sus combinaciones.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha molécula lleva una mutación puntual en Ser481 a Ala, y tiene la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEC ID N° 1, o un fragmento de la misma sin residuos RS de aminoácidos adicionales en N-terminal, dicho fragmento tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE.

5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, en la que dicha composición es para su uso en el tratamiento, mejora o profilaxis de una afección patológica que implica lesión neurológica o una enfermedad o afección isquémica.

6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha enfermedad o afección isquémica es ictus y en la que dicha afección patológica que implica lesión neurológica es una cualquiera de lesión cerebral aguda o traumática y un trastorno neurodegenerativo, preferiblemente, dicha afección patológica que implica lesión neurológica es una lesión cerebral aguda o traumática (LCT).

7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para aumentar la permeabilidad de la BHE (barrera hematoencefálica) en un sujeto en necesidad de la misma.

8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, en la que dicho secuestrante de glutamato se selecciona del grupo que consiste en glutamato-piruvato transaminasa (GPT), glutamato-oxaloacetato transaminasa (GOT), glucagón, insulina o cualquier composición o combinación de los mismos.

9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición conduce a la reducción de la NSS (puntuación de la gravedad neurológica) en un sujeto en necesidad de la misma.

10. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de tPA mutado desprovista de actividad de serínproteasa, que tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE, en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, mejora o profilaxis de una afección patológica que implica lesión neurológica o una enfermedad o afección isquémica, en el que dicha composición es para administración parenteral, dicha administración parenteral es una cualquiera de administración intraperitoneal (i.p.), subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) e intradérmica.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad o afección isquémica ictus y en el que dicha afección patológica que implica lesión neurológica es uno cualquiera de lesión cerebral aguda o traumática y un trastorno neurodegenerativo.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho muíante de tPA o cualquier composición o combinación del mismo conduce a al menos una de reducción de la NSS (puntuación de la gravedad neurológica) en un sujeto en necesidad del mismo y el aumento de la permeabilidad de la BHE (barrera hematoencefálica) en un sujeto en necesidad del mismo.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha composición comprende un agente terapéutico adicional, un secuestrante de glutamato seleccionado del grupo que consiste en glutamato-piruvato transaminasa (GPT), glutamato-oxaloacetato transaminasa (GOT), glucagón, insulina o cualquier composición o combinación de los mismos.

14. Una forma de dosificación farmacéutica unitaria que comprende al menos una molécula de tPA mutado desprovista de actividad de serínproteasa que tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE, o cualquier combinación o mezcla de los mismos, o un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos, y al menos de un secuestrante de glutamato seleccionado del grupo que consiste en glutamato-piruvato transaminasa

(GPT), glutamato-oxaloacetato transaminasa (GOT), glucagón, insulina o cualquier combinación de los mismos, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

15. Un kit para conseguir un efecto terapéutico en un sujeto en necesidad del mismo que comprende:

a. al menos una molécula de tPA mutado desprovisto de actividad de serínproteasa que tiene la capacidad de aumentar la permeabilidad de la BHE o cualquier combinación o mezcla de los mismos, o un derivado

farmacéuticamente aceptable de la misma y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una

primera forma de dosificación unitaria;

b. al menos un secuestrante de glutamato seleccionado del grupo que consiste en glutamato-piruvato transaminasa (GPT), glutamato-oxaloacetato transaminasa (GOT), glucagón, insulina o cualquier combinación de los mismos y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación

unitaria; y

c. medio de recipiente para contener dichas primera y segunda formas de dosificación; preferentemente, dicho sujeto está sufriendo una afección patológica que Implica lesión neurológica o una enfermedad o afección isquémica.