Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que induce la activación de una proteína STAT,

la secuencia complementaria de la que hibrida, bajo condiciones rigurosas, a al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, en donde las condiciones rigurosas comprenden la hibridación a 65ºC en 3.5xSSC, seguido de lavados a temperatura ambiente en 2xSSC y a 65ºC en 0.1xSSC;

con la condición de que dicha molécula de ácido nucleico sea diferente de:

un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1



(b) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del nucleótido 65 al nucléotido 601;

(c) la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon hGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína de longitud completa;

(d) la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon HGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína madura;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2



(f) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende aproximadamente del aminoácido 34 a 179 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y

(g) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-1 77 de SEQ ID NO:2

Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican Factores Inducibles de Células T, proteínas codificadas y usos de las mismas.

Campo de la invención

La invención se refiere a nuevas moléculas de ácido nucleico aisladas y a sus usos. Se ha comprobado que las moléculas de ácido nucleico se encuentran sobre-reguladas por la citoquina interleuquina 9 ("IL-9"). También se describen proteínas codificadas por las mismas. Estas se describen como Factores Inducibles Derivados de Células T ("TIFs"). Estas moléculas de ácido nucleico codifican proteínas que inducen la activación de STAT en las células. Se pueden usar, por ejemplo, en la estimulación de la regeneración de tejidos diana. Además, sus inhibidores o antagonistas se pueden usar para retardar, prevenir o inhibir la diferenciación de otros tejidos.

Antecedentes y técnica anterior

En la última década se ha visto incrementado de una manera importante el conocimiento del sistema inmune y su regulación. La búsqueda de proteínas y glicoproteínas que regulan el sistema inmune ha sido un área de particular interés. Una de las familias de estas moléculas que mejor se conoce es la de las citoquinas. Estas son moléculas que están implicadas en la "comunicación" de unas células con otras. Se ha encontrado que miembros individuales de la familia de citoquinas están implicados en una gran variedad de afecciones patológicas, tales como el cáncer y las alergias. Si bien algunas veces las citoquinas están implicadas en la patología de la afección, también se conocen por ser terapéuticamente útiles.

Las interleuquinas son un tipo de citoquina. La literatura sobre interleuquinas es inmensa. A modo de ejemplo, pero sin que signifique un listado exhaustivo de patentes en esta área, se incluyen la patente US Nº 4.778.879 de Mertelsmann et al.; la patente US Nº 4.490.289 de Stern; la patente US Nº 4.518.584 de Mark et al.; y la patente US Nº 4.851.512 de Miyaji et al., estando implicada, en todas ellas, la interlequina 2 o "IL-2." Se han publicado patentes adicionales que se refieren a la interleuquina 1 ("IL-1"), tal como la patente US Nº 4.808.611 de Cosman. Patentes más recientes que incluyen otras interleuquinas diferentes incluyen las patentes US Nº 5.694.234 (IL-13); 5.650.492 (IL-12); 5.700.664, 5.371.193 y 5.215.895 (IL-11); 5.728.377, 5.710.251, 5.328.989 (IL-10); 5.580.753, 5.587.302, 5.157.112, 5.208.218 (IL-9); 5.194.375, 4.965.195 (IL-7); 5.723.120, 5.178.856 (IL-6), y 5.017.691 (IL-4). Incluso una revisión rápida de esta literatura de patentes muestra la diversidad en las propiedades de los miembros de la familia de interleuquina. Uno puedo asumir que la mayor parte de la familia de citoquinas muestra incluso una mayor diversidad. Véase, por ejemplo, Aggarwal et al., ed., Human Cytokines: Handbook For Basic And Clinical Research (Blackwell Scientific Publications, 1992), Paul, ed., Fundamental Immunology (Raven Press, 1993), p. 763-836, "T-Cell Derived Cytokines And Their Receptors", y "Proinflammatory Cytokines and Immunity."

Las relaciones entre las diversas citoquinas son complejas. Como se verá a partir de las referencias citadas en el presente documento, cuando el nivel de una citoquina concreta aumenta o disminuye, esto puede afectar, ya sea de manera directa o indirecta, a los niveles de otras moléculas producidas por un sujeto. Entre las moléculas afectadas hay otras citoquinas.

La linfoquina IL-9, previamente referida como "P40," es una molécula derivada de célula T que originalmente se identificó como un factor que mantenía el crecimiento independiente de antígeno permanente de líneas celulares T4. Véase, por ejemplo, Uyttenhove et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6934 (1988), y Van Snick et al., J. Exp. Med. 169: 363 (1989), y Simpson et al., Eur. J. Biochem. 183: 715 (1989).

La actividad de IL-9 se observó primero en líneas de células T4 restringidas, que dejaban de mostrar actividad en células T aisladas frescas o CTL. Véase, por ejemplo, Uyttenhove et al., más arriba, y Schmitt et al., Eur. J. Immunol. 19: 2167 (1989). Este rango de actividad se amplió cuando los experimentos mostraron que IL-9 y la molécula referida como Factor de crecimiento III de células T ("TCGF III") son idénticas a MEA (Actividad protenciadora del crecimiento de mastocitos), un factor que potencia la respuesta proliferativa de los mastocitos derivados de médula a IL-3, según ha sido descrito por Hültner et al., Eur. J. Immunol, y en la patente US número 5.164.317. También se encontró que la forma humana de IL-9 estimula la proliferación de leucemia megacarioblástica. Véase Yang et al., Blood 74: 1880 (1989). Un trabajo reciente sobre IL-9 ha demostrado que esta también ayuda en la formación de la colonia eritroide (Donahue et al., Blood 75(12): 2271-2275 (6-15-90)); promueve la proliferación de la formación de brotes mieloides eritroides (Williams et al., Blood 76: 306-311 (9-1-90); y ayuda en la maduración clónica de BFU-E's de origen fetal y adulto (Holbrook et al., Blood 77(10): 2129-2134 (5-15-91)). La expresión de IL-9 también se ha implicado en la enfermedad de Hodgkins disease y en el linfoma anaplásico de células grandes (Merz et al., Blood 78(8): 1311-1317 (9-1-90). Los análisis genéticos de ratones que eran susceptibles o resistentes al desarrollo de hiper-respuestas bronquiales han desenmarañado un enlace con el gen de IL-9 así como una correlación entre la producción de IL-9 y la susceptibilidad en este modelo (Nicolaides et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13175-13180, 1997). Los estudios genéticos humanos también apuntan a los genes de IL-9 y IL-9R como candidatos a asma (Doull et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153, 1280-1284, 1996; Holroyd et al., Genomics 52, 233-235, 1998). En segundo lugar, los ratones transgénicos con IL-9 permitieron demostrar que una expresión aumentada de IL-9 resultaba en mastocitosis pulmonar, hipereosinofilia, hiper-respuesta bronquial y elevados niveles de IgE (Temann et al., J. Exp. Med. 188, 1307-1320, 1998; Godfraind et al., J. Immunol. 160, 3989-3996, 1998; McLane et al., Am. J. Resp. Cell. Mol. 19:713-720 (1999). Consideradas juntas todas estas observaciones, sugieren que IL-9 juega un papel principal en esta enfermedad. Un trabajo adicional ha implicado IL-9 y las muteínas de esta citoquina en asma y alergias. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT US96/12757 (Levitt, et al), y PCT US97/21992 (Levitt, et al).

IL-9 es conocida por afectar los niveles de otras moléculas en los sujetos. Véase Louahed et al., J. Immunol. 154: 5061-5070 (1995; Demoulin et al., Mol. Cell. Biol. 16: 4710-4716 (1996). Se reconocerá que las moléculas afectadas tienen sus propias funciones en los sistemas biológicos. Por ejemplo, Demoulin et al. muestran que muchas de las actividades conocidas de IL-9 están mediadas por la activación de los factores de transcripción STAT. Como tal, existe un interés continuo en intentar identificar moléculas cuya presencia y/o nivel se vea afectado por otras moléculas tales como citoquinas.

WO 00/65027 reivindica prioridad de 28-4-99 y se publicó el 2.11.00. Esta solicitud describe una proteína similar a IL-10 que tiene una secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante de la proteína de longitud completa del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 20723. La solicitud describe una secuencia de ácido nucleico y aminoacídica humanas (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) de una proteína referida como proteína hTIF/AE289.

La descripción que sigue describe estas moléculas. Se encontró que las moléculas de ácido nucleico que codificaban las proteínas de la invención se expresaban en presencia de IL-9, pero no en su ausencia. Por lo tanto, estas moléculas son, entre otros, "marcadores" de expresión o efecto de IL-9 en un sujeto. Las moléculas se refieren de aquí en adelante como Factores Inducibles derivados de Células T o "TIFs". Estas y otras características se verán en la descripción que sigue.

Resumen de la invención

La presente invención describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que induce la activación de una proteína STAT, la secuencia complementaria con la que hibrida, bajo condiciones rigurosas, a al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, en donde las condiciones rigurosas comprenden la hibridación a 65ºC en 3.5xSSC, seguido de lavados a temperatura ambiente en 2xSSC y a 65ºC en 0.1xSSC;...

1. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que induce la activación de una proteína STAT, la secuencia complementaria de la que hibrida, bajo condiciones rigurosas, a al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, en donde las condiciones rigurosas comprenden la hibridación a 65ºC en 3.5xSSC, seguido de lavados a temperatura ambiente en 2xSSC y a 65ºC en 0.1xSSC;

con la condición de que dicha molécula de ácido nucleico sea diferente de:

un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1

(b) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del nucleótido 65 al nucléotido 601;

(c) la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon hGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína de longitud completa;

(d) la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon HGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína madura;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2

(f) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende aproximadamente del aminoácido 34 a 179 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y

(g) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-1 77 de SEQ ID NO:2.

2. Molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

3. Molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que dicha molécula es cDNA.

4. Molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde dicha molécula es DNA genómico.

5. Molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, la secuencia nucleotídica consistiendo en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.

6. Molécula de ácido nucleico que codifica la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.

7. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor.

8. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de la reivindicación 5, en donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor.

9. Célula recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

10. Célula recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.

11. Proteína aislada codificada por la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 y que tiene un peso molecular de aproximadamente 17-30 kilodaltons según se determina por SDS-PAGE.

12. Proteína aislada de la reivindicación 11 que comprende al menos 120 aminoácidos de la proteína codificada por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

13. Proteína aislada de la reivindicación 12, que comprende al menos todos excepto los 40 aminoácidos N-terminales codificados por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

14. Proteína aislada de la reivindicación 13, que comprende al menos todos excepto los 20 aminoácidos N-terminales codificados por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

15. Anticuerpo que se une de manera específica a la proteína aislada de la reivindicación 11.

16. Anticuerpo de la reivindicación 15, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

17. Método in vitro para determinar la eficacia de la interleuquina-9 en una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con un agente específico para al menos uno de:

(i) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29; y

(ii) una proteína cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29;

y determinar la interacción de dicho agente con (i) o (ii) como determinación de la efectividad de la interleuquina-9 en dicha célula;

en donde dicho agente se selecciona de entre una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29, y un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

18. Método de la reivindicación 17 donde dicho agente es un anticuerpo que se une de manera específica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

19. Método de la reivindicación 17 en donde dicho agente comprende la complementaria aislada de la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

20. Proteína de acuerdo con la reivindicación 11 para usar en un método de estimulación de la activación de una proteína STAT.

21. Método para determinar la presencia de una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29 en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con un agente que se une a dicha proteína o dicha molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29, y determinar dicha unión como determinación de dicha proteína en dicha muestra, en donde dicho agente se selecciona de un anticuerpo y una molécula de ácido nucleico.

22. Método de la reivindicación 21, en donde dicho agentes es un anticuerpo.

23. Método de la reivindicación 21, en donde dicho agentes es una molécula de ácido nucleico.

24. Método in vitro de cribado para determinar si una sustancia influye en la actividad de IL-9, que comprende añadir dicha sustancia a una muestra de células que producen una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29, en presencia de IL-9, y determinar la producción de dicha proteína, en donde una diferencia en la producción de dicha proteína por dichas células, cuando se compara con la producción de dicha proteína por dichas células en presencia de IL-9 pero sin dicha sustancia, indica que dicha sustancia influye en la actividad de IL-9.

25. Método de la reivindicación 24, en donde dicha sustancia es un inhibidor o antagonista de IL-9, dicho método comprendiendo determinar niveles bajos en la producción de dicha proteína por dichas células en presencia de dicha sustancia cuando se compara con su ausencia.

26. Método de la reivindicación 24, en donde dicha sustancia es un activador de IL-9, dicho método comprendiendo adicionalmente determinar niveles elevados en la producción de dicha proteína por dichas células en presencia de dicha sustancia cuando se compara con su ausencia.

27. Método in vitro para determinar un nivel aberrante de actividad IL-9 en un sujeto, que comprende determinar el nivel de una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29 en un sujeto y comparar dicho nivel con un nivel normal, las diferencias entre ellas siendo indicativas de un nivel aberrante de IL-9 en dicho sujeto.

28. Método de la reivindicación 27, en donde dicho nivel aberrante es de IL-9 endógena en exceso.

29. Método de la reivindicación 27, en donde dicho nivel aberrante es de IL-9 endógena insuficiente.

30. Método de la reivindicación 28, en donde dicho sujeto sufre de asma, alergia o linfoma.

31. Inhibidor de una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29 suficiente para inhibir la actividad inducida por IL-9 para su uso en un método de inhibición de la actividad inducida por IL-9 en un sujeto que lo necesite, en donde dicho inhibidor se selecciona de un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29 y una molécula antisentido.

32. Inhibidor para usar de acuerdo con la reivindicación 31, en donde dicho inhibidor es una molécula antisentido.

33. Inhibidor para usar de acuerdo con la reivindicación 31, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.

34. Método in vitro para determinar si una muteína de una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29 es terapéuticamente útil, que comprende poner en contacto una célula que producía IL-9 con dicha muteína, y determinar el efecto de dicha muteína en la producción de IL-9, la reducción de la misma siendo indicativa de la posible eficacia terapéutica de dicha muteína.