Moduladores de factores de coagulación mejorados.

Un aptámero que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID N.º: 19.

Moduladores de factores de coagulación mejorados Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. N.°: 6/564.873, presentada el 22 de abril de 24.

Campo técnico

La invención es un agente mejorado, una composición y un procedimiento para regular la actividad farmacológica de un factor de coagulación con ligandos de ácido nucleico (p. ej., aptámeros).

Antecedentes

A pesar de los esfuerzos sustanciales para tratar y prevenir episodios trombóticos, la trombosis arterial sigue siendo la principal causa de muerte en la población adulta de los países industrializados. Aunque existen numerosas estrategias médicas para tratar la trombosis, ninguno de los agente disponibles cumple los criterios terapéuticos tanto de biodisponibilidad como eficacia y presenta al mismo tiempo un perfil de seguridad razonable (véase Feuerstein etal. (1999) Arteríoscler. Thromb. Vasc. Biol. 19: 2554-2562).

En circunstancias normales, una lesión en las células endoteliales vasculares que tapizan los vasos sanguíneos desencadena una respuesta hemostática a través de una secuencia de acontecimientos que comúnmente se denomina la "cascada" de coagulación. La cascada culmina en la conversión del fibrinógeno soluble en fibrina insoluble que, junto con las plaquetas, forma un coágulo localizado o trombo que previene la liberación extravascular de componentes de la sangre. Después se puede producir la curación de la herida seguida de la disolución del coágulo y el restablecimiento de la integridad del vaso sanguíneo y el flujo.

El comienzo de la coagulación sanguínea surge de dos rutas independientes: las rutas intrínseca y extrínseca. La ruta intrínseca se puede activar in vitro por contacto de factores transportados en la sangre con superficies cargadas negativamente artificiales tales como vidrio. Por el contrario, la ruta extrínseca se puede iniciar in vivo o in vitro cuando el factor tisular (TF), normalmente secuestrado del aparato circulatorio, entra en contacto con la sangre después de la lesión. El TF expuesto a la sangre actúa como cofactor para la activación del factor IX ("FIX") y el factor X ("FX") catalizada por el factor Vlla ("FVIIa"). Esto da lugar a una formación rápida de FXa y trombina, que posteriormente se polimeriza para formar el coágulo de fibrina. Tanto la ruta intrínseca como la extrínseca se caracterizan por el ensamblaje de varios complejos de proteínas sobre superficies procoagulantes, que localizan la respuesta en el sitio de la lesión (véase Mann, K. G, et al., (199) Blood 76:1).

Tratamiento anticoagulante

Los fármacos de cumarina, tales como la warfarina, así como los glucosaminoglucanos, la heparina y el sulfato de heparano, se usan comúnmente como anticoagulantes. La warfarina, un derivado de la cumarina, actúa compitiendo con la modificación postraduccional dependiente de la vitamina K de la protrombina y otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K. Su acción es en cierta medida más lenta y con un efecto de duración más prolongada que la heparina. Los fármacos de cumarina inhiben la coagulación al inhibir las reacciones de carboxilación dependientes de vitamina K necesarias para la función de la trombina y los factores XII, IX y X, así como de las proteínas C y S. Estos fármacos actúan inhibiendo la reducción de los derivados de quinona de la vitamina K a sus formas de hidroquinona activas. Debido al modo de acción de los fármacos de cumarina, su efecto máximo tarda varios días en manifestarse. La heparina se une a y activa la antitrombina III que después inhibe las serinproteasas de la cascada de coagulación. En parte debido a su potencia, la heparina y la heparina BPM presentan inconvenientes. Las hemorragias descontroladas son una complicación principal observada en hasta el 7 % de los pacientes que reciben infusiones continuas y hasta el 14% de los pacientes a los que se les administran dosis intermitentes en embolada. El intervalo terapéutico para lograr la eficacia sin poner al paciente en riesgo de hemorragia es estrecho, de aproximadamente 1 a menos de 3 pg de heparina/ml de plasma. A concentraciones mayores de 4 pg/ml de heparina, la actividad de coagulación no es detectable. Por tanto, es necesario poner mucha atención en mantener las concentraciones plasmáticas del paciente dentro del intervalo terapéutico.

Algunos grupos han usado anticuerpos frente a factores de coagulación para regular la cascada de coagulación. Por ejemplo, en la publicación PCT N.°: WO 3/93422 de Schering Aktiengesellschaft se divulgan anticuerpos que se unen con mayor afinidad al complejo de factor Vlla/factor tisular (FVIIa/TF) que al factor tisular (TF) solo. Al parecer, estos anticuerpos no compiten por unirse al factor tisular con el factor Vil y el factor X e inhiben la activación del FX.

En la patente de EE.UU. N.°: 6.1.82 de Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. se proporcionan agentes catalíticos específicos del cofactor H de la heparina que pueden (1) inactivar de forma selectiva la trombina que está unida bien a la fibrina de un coágulo o bien a alguna otra superficie, pero que no tiene más que una

actividad inhibidora mínima frente a la trombina libre; (2) inhibir el ensamblaje del complejo tenasa intrínseco y de este modo la activación del factor X por el factor IXa; y (3) inhibir la activación del factor IX por el factor Xla.

Liu et al. (FEBS Letters, págs. 125-128, 24) se ocupa del cribado de antídotos funcionales de aptámeros de ARN frente a la trombina bovina. Sullenger BA (Ernst Schering Res Found Workshop, 23 vol. 43, págs. 217-223) se ocupa de aptámeros y antídotos terapéuticos: un enfoque novedoso para un diseño de fármacos más seguro. Smirnov et al. (Biochemistry, 2 vol. 39, págs. 1462-1468) se ocupa del efecto de la secuencia de bucle y el tamaño en la estabilidad de los aptámeros de ADN.

Aptámeros

Tradicionalmente se ha creído que los ácidos nucleicos desempeñaban un papel principalmente informativo en los procesos biológicos. En la pasada década ha quedado claro que la estructura tridimensional de los ácidos nucleicos puede dotarlos de la capacidad de ¡nteraccionar con las proteínas y regularlas. Estos ligandos de ácido nucleico o "aptámeros" son oligómeros cortos de ADN o ARN que se pueden unir a un ligando dado con alta afinidad y especificidad. Como clase, las estructuras tridimensionales de los aptámeros son los suficientemente variables para permitir que los aptámeros se unan a y actúen como ligandos para prácticamente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico. Los aptámeros han surgido como nuevos compuestos de diagnóstico y terapéuticos prometedores, en particular en el tratamiento del cáncer y la regulación de la coagulación sanguínea.

Se pueden identificar ligandos de ácido nucleico a través de procedimientos relacionados con un procedimiento denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX). SELEX conlleva la selección de ácidos nucleicos que se unen a proteínas a partir de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones por etapas de unión, reparto y amplificación para alcanzar el criterio deseado de afinidad de unión y selectividad. El procedimiento SELEX lo describieron por primera vez Gold y Tuerk en la patente de EE.UU. N.°: 5.475.96 y posteriormente, en la patente de EE.UU. N.°: 5.27.163 (véase también el documento WO 91/19813; Tuerk et al. (199) Science 249: 55-1).

Otros varios han solicitado y asegurado patentes que cubrían la Identificación, la fabricación y el uso de aptámeros. Como se indica anteriormente, por lo general se reconoce a Gold y Tuerk el desarrollo en primer lugar el procedimiento SELEX para aislar aptámeros y su procedimiento se describe en una serie de patentes de Estados Unidos, incluidas las patentes de EE.UU. N.°s: 5.67.637, 5.696.249, 5.843.653, 6.11.9 y 5.27.163. Thomas Bruice et al. informaron de un procedimiento para producir aptámeros en la patente de EE.UU. N.°: 5.686.242, que difiere del procedimiento SELEX original comunicado por Tuerk y Gold porque emplea oligonucleótidos estrictamente aleatorios durante el cribado de secuencias. Los oligonucleótidos cribados en la patente '242 carecen de los cebadores oligonucleotídicos que están presentes en los oligonucleótidos cribados en el procedimiento SELEX.

Varias patentes de Gold et al. contienen reivindicaciones que cubren aptámeros para la trombina. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.°: 5.67.637 contiene reivindicaciones que cubren aptámeros que se unen a proteínas. En la patente de EE.UU. N.°: 5.696.249 se reivindica un aptámero producido por el procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un aptámero que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID N.°: 19.

2. El aptámero de la reivindicación 1 que comprende una cola monocatenarla de 1-2 nucleótldos.

3. El aptámero de la reivindicación 1 que comprende una cola monocatenarla de 1-1 nucleótldos.

4. El aptámero de la reivindicación 1 que comprende una cola monocatenarla de 1-5 nucleótidos.

5. El aptámero de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende uno o más nucleótidos

2'--metil modificados.

6. El aptámero de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende una o más modificaciones 2'-fluoro.

7. El aptámero de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos no comprende modificaciones 2'- fluoro.

8. El aptámero de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende un primer tallo y un segundo tallo y en el que al menos una guanina en el segundo tallo comprende un azúcar hidroxilado (2'-OH).

9. El aptámero de la reivindicación 1, que comprende al menos una uridina modificada con 2'-fluoro o con 2'-- metilo.

1. El aptámero de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende un primer tallo y un segundo tallo y en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende al menos una citidina en el segundo tallo, en el que la al menos una citidina está modificada con 2'-fluoro.

11. El aptámero de la reivindicación 1, que comprende la SEC ID N.°: 59.

12. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la secuencia de ácidos nucleicos está modificada con un polímero soluble en agua.

13. El aptámero de la reivindicación 12, en el que el polímero es polietilenglicol.

14. El aptámero de la reivindicación 13, en el que el polietilenglicol es un polietilenglicol de 4 kD.

15. El aptámero de la reivindicación 13, en el que el polietilenglicol está enlazado al extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos a través de un enlazador amino de seis carbonos.

16. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en el que la secuencia de ácidos nucleicos comprende un sitio de unión a antídoto, en el que el antídoto que se une al sitio de unión a antídoto comprende la

SEC ID N.°: 3.

17. Un antídoto que comprende una secuencia complementaria a 6-25 nucleótidos consecutivos de un aptámero objetivo, en el que el aptámero objetivo consiste en la SEC ID N.°: 19.

18. El antídoto de la reivindicación 17, en el que la secuencia de ácidos nucleicos aislada comprende la SEC ID N.°:

1, la SEC ID N.°: 2, la SEC ID N.°: 3, la SEC ID N.°: 4, la SEC ID N.°: 5, la SEC ID N.°: 6, la SEC ID N.°: 7 o la SEC

ID N.°: 8.

19. El antídoto de la reivindicación 17, en el que la secuencia de ácidos nucleicos aislada comprende opcionalmente uno o más nucleótidos 2'--metil modificados.

2. El antídoto de la reivindicación 17, en el que la secuencia de ácidos nucleicos aislada comprende opcionalmente una o más modificaciones 2-fluoro.

21. El antídoto de la reivindicación 17, en el que la secuencia de ácidos nucleicos aislada está modificada con un polímero soluble en agua.

22. El antídoto de la reivindicación 21, en el que el polímero es polietilenglicol.

23. Una composición farmacéutica que comprende el aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. La composición de la reivindicación 23, que comprende además un segundo ácido nucleico aislado según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 17-22.

25. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del antídoto de una cualquiera de las reivindicaciones 17-22, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en la que la composición es adecuada para administración sistémica, administración intravenosa, administración oral, administración parenteral o administración subcutánea.

27. Un aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en un procedimiento de inhibición de la coagulación en un huésped.

28. Un aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en un procedimiento de prevención de la inflamación inducida por coagulación en un huésped.

29. Los aptámeros para su uso de acuerdo con la reivindicación 27 o con la reivindicación 28, en los que el huésped se somete a un tratamiento terapéutico.

3. Los aptámeros para su uso de acuerdo con la reivindicación 27 o con la reivindicación 28, en los que el huésped se somete a una intervención quirúrgica.

31. Los aptámeros para su uso de acuerdo con la reivindicación 27 o con la reivindicación 28, en los que el huésped padece, o tiene riesgo de padecer, una cardiovasculopatía o una intervención quirúrgica que provoque o dé lugar a un episodio inductor de la coagulación.

32. Los aptámeros para su uso de acuerdo con la reivindicación 27 o con la reivindicación 28, en los que el huésped padece, o tiene riesgo de padecer, un trastorno seleccionado del grupo que consiste en infarto agudo de miocardio (ataque al corazón), accidentes cerebrovasculares (apoplejía), isquemia, angioplastia, IDAC (injerto de derivación aortocoronaria), circulación extracorpórea, trombosis en el circuito del aparato de derivación cardíaca y en pacientes sometidos a diálisis renal, angina inestable, embolia pulmonar, flebotrombosis profunda, trombosis arterial y coagulación intravascular diseminada.

33. Los aptámeros para su uso de acuerdo con la reivindicación 27 o con la reivindicación 28, en los que la inflamación inducida por la coagulación se asocia con un trastorno seleccionado del grupo que consiste en aterosclerosis, síndrome coronario agudo (SCA), infarto de miocardio, lesión por reperfusión y reestenosis postangioplastia.

34. El antídoto de una cualquiera de las reivindicaciones 17-22 para uso en la reversión de los efectos anticoagulantes de uno cualquiera de los aptámeros de las reivindicaciones 27-33 en un mamífero que lo necesite.

35. El uso de un aptámero, en el que dicho aptámero es uno cualquiera de los aptámeros de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, en la fabricación de un medicamento para inhibirla coagulación en un huésped.

36. El uso de un aptámero, en el que dicho aptámero es uno cualquiera de los aptámeros de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, en la fabricación de un medicamento para prevenir la inflamación inducida por coagulación en

un huésped.

37. El uso de un antídoto, en el que dicho antídoto es uno cualquiera de los antídotos de acuerdo con las reivindicaciones 17-22, en la fabricación de un medicamento para revertir los efectos anticoagulantes en un mamífero que lo necesite de uno cualquiera de los aptámeros de las reivindicaciones 35-36 usados en la fabricación de un medicamento para prevenir la inflamación inducida por coagulación en un huésped.