Moduladores de agentes farmacológicos.

Uso de un modulador oligonucleotídico en la fabricación de un medicamento para revertir de forma específica y rápida los efectos anticoagulantes y antitrombóticos de un aptámero contra factores de coagulación que está dirigido a componentes de la vía de coagulación en un huésped que recibe el aptámero,

en el que el aptámero contra factores de coagulación es un ácido nucleico monocatenario que se une a un factor de coagulación, y en el que el modulador oligonucleotídico hibrida bajo condiciones fisiológicas al aptámero contra factores de coagulación.

Moduladores de agentes farmacolïgicos Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nï 60/293.231, presentada el 25 de mayo de 2001, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nï 60/331.037, presentada el 7 de noviembre de 2001.

Campo tïcnico La presente invenciïn se refiere, en general, a un modulador oligonucleotïdico que revierte la actividad farmacolïgica de un aptïmero contra factores de coagulaciïn.

Antecedentes Convencionalmente se ha pensado que los ïcidos nucleicos desempeïan principalmente una tarea informativa en procesos biolïgicos. A travïs de un mïtodo conocido como Evoluciïn Sistemïtica de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial, llamado SELEX, ha quedado claro que los ïcidos nucleicos tienen diversidad estructural tridimensional no diferente a las proteïnas. SELEX es un mïtodo para la sïntesis in vitro y la selecciïn de molïculas de ïcido nucleico con uniïn altamente especïfica a molïculas diana. El proceso SELEX se describiï por primera vez por Gold y Tuerk en la solicitud de patente de Estados Unidos Nï Ser. 07/536.428, presentada el 11 de junio de 1990, ahora Patente de Estados Unidos Nï 5.475.096, y despuïs en la solicitud de patente de Estados Unidos Nï Ser. 07/931.473, presentada el 17 de agosto de 1992, titulada "Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands (Mïtodos para identificar ligandos de ïcido nucleico) ", ahora Patente de Estados Unidos Nï 5.270.163 (vïase tambiïn el documento WO 91/19813) . Vïase tambiïn Tuerk et al., Science 249:505-10 (1990) .

Los ligandos de ïcido nucleico o aptïmeros son ïcidos nucleicos (ADN o ARN) monocatenarios no codificantes que tienen la propiedad de unirse especïficamente a un compuesto o molïcula diana deseado, y que tienen suficiente capacidad para formar una diversidad de estructuras bi y tridimensionales y suficiente versatilidad quïmica disponible dentro de sus monïmeros para actuar como ligandos (formar pares de uniïn especïficos) con casi cualquier compuesto quïmico, sea monomïrico o polimïrico. Molïculas de cualquier tamaïo o composiciïn pueden servir como dianas. El mïtodo SELEX implica la selecciïn entre una mezcla de oligonucleïtidos candidatos e iteraciones por etapas de uniïn, separaciïn y amplificaciïn, usando el mismo esquema de selecciïn general, para conseguir casi cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de uniïn. Partiendo de una mezcla de ïcidos nucleicos, preferiblemente compuesta por segmentos de secuencias aleatorizadas, el mïtodo SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la uniïn, separar los ïcidos nucleicos no unidos de aquellos ïcidos nucleicos que se han unido especïficamente a molïculas diana, disociar los complejos ïcido nucleico-diana, amplificar los ïcidos nucleicos disociados de los complejos ïcido nucleico-diana para producir una mezcla de ïcidos nucleicos enriquecida con ligando, despuïs reiterar las etapas de uniïn, separaciïn, disociaciïn y amplificaciïn a travïs de todos los ciclos que se deseen para producir ligandos de ïcido nucleico de elevada afinidad altamente especïficos para la molïcula diana.

Los ligandos de ïcido nucleico tienen varias caracterïsticas que pueden volverlos ïtiles como agentes terapïuticos. Pueden prepararse como compuestos sintïticos relativamente pequeïos (por ejemplo, de 8 kDa a 15 kDa) y pueden seleccionarse para que tengan elevada afinidad y especificidad por molïculas diana (constantes de disociaciïn en equilibrio que varïan de, por ejemplo, 0, 05-10 nM) . Los aptïmeros abarcan tanto las propiedades de afinidad de los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos de cadena sencilla (scFv) como la facilidad de fabricaciïn similar a la de un pïptido pequeïo. Estudios iniciales demostraron el uso in vitro de los aptïmeros para estudiar la funciïn proteica, y estudios mïs recientes han confirmado la utilidad de estos compuestos para estudiar la funciïn proteica in vivo (Floege et al., Am J Pathol 154:169-179 (1999) , Ostendorf et al., J Clin Invest 104:913-923, (1999) ) . Ademïs, estudios en animales hasta la fecha han mostrado que los aptïmeros y compuestos de composiciïn similar se toleran bien, muestran baja o ninguna inmunogenicidad, y son por tanto adecuados para la administraciïn repetida como compuestos terapïuticos (Floege et al., Am J Pathol 154:169-179 (1999) , Ostendorf et al., J Clin Invest 104:913-923 (1999) , Griffin et al., Blood 81:3271-3276 (1993) , Hicke et al., J Clin Invest 106:923-928 (2000) ) .

Como compuestos sintïticos, pueden hacerse modificaciones especïficas de sitio (inserciones o deleciones) a los aptïmeros para alterar de forma racional su biodisponibilidad y modo de eliminaciïn. Por ejemplo, se ha descubierto que aptïmeros modificados con 2’-fluoro pirimidina en el intervalo de tamaïo de 10 kDa a 12 kDa tienen una vida media en circulaciïn corta (!10 minutos) despuïs de administraciïn intravenosa en embolada pero que una simple modificaciïn quïmica del aptïmero o la conjugaciïn del aptïmero con una molïcula vehïculo de elevado peso molecular (por ejemplo, PEG) aumenta la vida media en circulaciïn sustancialmente (6-12 horas) (Willis et al., Bioconjug Chem 9:573-582 (1998) , Tucker et al., J Chromatogr Biomed Sci Appl 732:203-212 (1999) , Watson et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:63-75 (2000) ) . Se han descrito ligandos de ïcido nucleico monocatenarios bioactivos y resistentes a nucleasa que comprenden L-nucleïtidos (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:11285 (1997) ; documento USP 5.780.221; Leva et al., Chem. Biol. 9:351 (2002) ) . Estos "L-aptïmeros" son, segïn se informa, estables en condiciones en las que los aptïmeros que comprenden nucleïtidos de quiralidad natural (D-nucleïtidos) (es decir, "D-aptïmeros") estïn sometidos a degradaciïn.

Varias terceras personas han solicitado y conseguido patentes que cubren la identificaciïn, fabricaciïn y uso de aptïmeros. Como se ha indicado anteriormente a Larr y Gold y Craig Tuerk se les atribuye generalmente el primer desarrollo del mïtodo SELEX para aislar aptïmeros, y su mïtodo se describe en varias patentes de Estados Unidos incluyendo aquellas mencionadas anteriormente y las Patentes de Estados Unidos Nï 5.670.637, 5.696.249, 5.843.653, 6.110.900, y 5.270.163, asï como otras descritas en la Descripciïn Detallada de la Invenciïn. Thomas Bruice et al. informaron de un proceso para producir aptïmeros en la Patente de Estados Unidos Nï 5.686.242, que difiere del proceso SELEX original presentado por Tuerk y Gold porque emplea oligonucleïtidos estrictamente aleatorios durante la secuencia de exploraciïn. Los oligonucleïtidos explorados en el proceso de la patente ‘242 carecen de los cebadores oligonucleotïdicos que estïn presentes en oligonucleïtidos explorados en el proceso SELEX.

Varias patentes de Gold et al. se refieren a los propios aptïmeros. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nï

6.114.120 se refiere a un aptïmero que se une a una macromolïcula celular. La Patente de Estados Unidos Nï

5.670.637 se refiere a aptïmeros que se unen a proteïnas. La Patente de Estados Unidos Nï 5.696.249 se refiere a un aptïmero producido por el proceso SELEX.

Se han expedido otras patentes que se refieren a aptïmeros contra dianas biolïgicas especïficas, y a los mïtodos para identificar estos aptïmeros. Las Patente de Estados Unidos Nï 5.756.291 y 5.582.981 de O’Toole, por ejemplo, describen un mïtodo para detectar trombina usando un aptïmero marcado que comprende una secuencia de seis nucleïtidos definida. Las Patentes de Estados Unidos Nï 5.527.894 y 5.637.461 de Gold et al. se refieren a mïtodos para identificar aptïmeros contra la proteïna tat. Otras patentes que describen aptïmeros dirigidos contra dianas biolïgicas especïficas incluyen las Patentes de Estados Unidos Nï 5.496.938 (transcriptasa inversa de VIH) ,

5.476.766 (trombina) , 5.459.015 (factor de crecimiento de fibroblastos) , 5.472.841 (elastasa de neutrïfilos) , 5.849.479 (factor de crecimiento del endotelio vascular) , 5.726.017 (GAG de VIH) , 5.731.144 (TGF∀) , 5.827.456 (hormona gonadotropina coriïnica) , 5.780.228 (lectinas) , 5.766.853 (selectinas) , 5.674.685 (factor de crecimiento derivado de plaquetas) , 5.763.173 (ADN polimerasas) , 6.140.490 (proteïnas del sistema del complemento) , y 5.869.641 (CD4) .

Sullenger, Rusconi, Kontos y White en el documento WO 0226932 A2 describen aptïmeros de ARN que se unen a factores de coagulaciïn, factores de transcripciïn de la familia E2F, Ang1, Ang2, y fragmentos o pïptidos de los mismos, factores de transcripciïn, anticuerpos autoinmunes y receptores de superficie celular ïtiles en la modulaciïn... [Seguir leyendo]

1. Uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï

dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero, en el que el aptïmero contra factores de coagulaciïn es un ïcido nucleico monocatenario que se une a un factor de coagulaciïn, y en el que el modulador oligonucleotïdico hibrida bajo condiciones fisiolïgicas al aptïmero contra factores de coagulaciïn.

2. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que dicho modulador oligonucleotïdico estï combinado con un vehïculo farmacïutico.

3. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la reivindicaciïn 1 o 2, en el que el modulador oligonucleotïdico es complementario al aptïmero contra factores de coagulaciïn.

4. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la reivindicaciïn 3, en el que el modulador oligonucleotïdico comprende una secuencia complementara a 6-25

nucleïtidos del aptïmero contra factores de coagulaciïn

5. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la reivindicaciïn 3, en el que el modulador oligonucleotïdico comprende 5-80 nucleïtidos.

6. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la

reivindicaciïn 3, en el que el modulador oligonucleotïdico comprende 10-30 nucleïtidos.

7. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modulador es complementario a una regiïn monocatenaria del aptïmero contra factores de coagulaciïn.

8. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï

dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modulador es complementario a una regiïn monocatenaria del aptïmero contra factores de coagulaciïn y a una regiïn bicatenaria del aptïmero contra factores de coagulaciïn.

9. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el componente de la vïa de coagulaciïn de la sangre es un receptor plaquetario gpIIbIIIa; receptor plaquetario gpIbIX; receptor plaquetario gpVI; un complejo enzimïtico de 55 factor tisular/factor de coagulaciïn VIla (TF/FVIIa) ; un complejo enzimïtico de factor de coagulaciïn VIlla/factor de coagulaciïn IXa (FVIIIa/FIXa) ; un complejo enzimïtico de factor de coagulaciïn Va/factor de coagulaciïn Xa (FVa/FXa) ; inhibidor del activador de plasminïgeno 1 (PAI-1) ; factor de coagulaciïn XIIIa (FXIIIa) ; anti-trombina III (ATIII) ; factor de coagulaciïn FIXa (FIXa) ; y factor de coagulaciïn XIa (FXIa) .

10. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modulador oligonucleotïdico alberga una sustituciïn quïmica.

11. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la reivindicaciïn 10 en el que el modulador comprende una pirimidina sustituida en la posiciïn 5' o un azïcar sustituido en una posiciïn 2'.

12. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con la reivindicaciïn 11, en el que el modulador comprende una sustituciï.

2. amino.

2. fluoro .

2. O-metilo.

13. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aptïmero contra factores de coagulaciïn alberga un marcador detectable, un marcador citotïxico o un marcador radioactivo.

14. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el modulador oligonucleotïdico comprende un ïcido nucleico cerrado.

15. El uso de un modulador oligonucleotïdico en la fabricaciïn de un medicamento para revertir de forma especïfica y rïpida los efectos anticoagulantes y antitrombïticos de un aptïmero contra factores de coagulaciïn que estï

dirigido a componentes de la vïa de coagulaciïn en un huïsped que recibe el aptïmero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente de la vïa de coagulaciïn de la sangre es Factor IXa, Factor Xa, o trombina.