Modulación de la capacidad de respuesta a los esteroides.

Uso de un oligonucleótido que tiene la secuencia

5'-Xm-GTTCGTC-Yn-3' (SEQ.

ID. No. 17)

para la fabricación de un medicamento para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a esteroides, afectado por una condición inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada a un tratamiento anti-inflamatorio, en donde X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m≥0-6, n≥0-6 y en donde al menos un dinucleótido CG no es metilado y dicho oligonucleótido tiene de 8 a 100 ácidos nucleicos de longitud.

Modulacion de la capacidad de respuesta a los esteroides Campo de la invencion La presente invencion se refiere al uso de oligonucleotidos para la fabricacion de un medicamento que puede ser utilizado en un metodo para la modulacion de la capacidad de respuesta a los esteroides en un paciente. En particular, la invencion se refiere al uso de tales oligonucleotidos para revertir la resistencia a esteroides o mejorar la capacidad de respuesta a los esteroides en un paciente permitiendo asi, que el sujeto sea tratado con esteroides tales que los esteroides alcancen el efecto anti-inflamatorio deseado.

Antecedentes La inflamacion es una enfermedad compleja que involucra muchos factores y tipos de celulas. Desde una perspectiva de la enfermedad, muchos aros de investigacion nos han enserado que un trastorno inflamatorio tal como asma, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, y enfermedad de Crohn y otros, tienen un perfil de citoquinas inflamatorias definido. Estos perfiles son el resultado de la naturaleza de los linfocitos de respuesta. En otras palabras, la inflamacion no se puede considerar simplemente como "inflamacion" sino mas bien como diferentes enfermedades inflamatorias asociadas con diferentes citoquinas secretadas que potencian la proliferacion y la diferenciacion de ciertas sub-poblaciones de celulas T auxiliares.

La naturaleza y la magnitud de una respuesta inmunitaria estan dictadas en gran medida por el perfil del antigeno foraneo al cual se ha expuesto el sistema inmunologico. Este evento pone en marcha una serie de eventos que finalmente conducen a la generacion de inmunidad humoral y mediada por las celulas. Estas dos diferentes funciones efectoras se ocasionan por la presencia de dos subpoblaciones de celulas T auxiliares. Como tambien se indica, diferentes enfermedades inflamatorias se pueden separar ya sea como Th1 o Th2, dependiendo del perfil de citoquinas observado.

En condiciones de salud "normales" existe un delicado equilibrio entre las citoquinas pro-inflamatorias tipicas de Th1 y las citoquinas anti-inflamatorias tipicas de Th2. Si este equilibrio se pierde, habra una polarizacion dando como resultado la inflamacion de tipo Th1 o Th2 predominantemente y se producira la manifestacion clinica de la enfermedad.

Algunas formas mas recientes de agentes terapeuticos ahora intentan restaurar el "equilibrio" por ejemplo, en enfermedades del tipo Th1 reduciendo el perfil de citoquinas de Th1 y permitiendo asi que se produzca un perfil mas de Th2 (Neurath et al, 1995; Mannon et al, 2004) . En los ultimos 5 aros mas o menos, muchos investigadores han demostrado tanto in vitro como in vivo la validez del uso de oligonucleotidos como agentes inmunoestimuladores en aplicaciones de inmunoterapia. La observacion de que los oligonucleotidos modificados con fosfodiester e incluso con fosforotioato pueden inducir la inmunoestimulacion ha creado un interes creciente en el desarrollo de este efecto como una herramienta terapeutica.

El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimuladores que pueden activar las celulas B y los linfocitos citoliticos naturales, pero el ADN de vertebrados no (revisado en Krieg, 1998, Applied Oligonucleotide Technology, C. A. Stein and A. M. Krieg, (Eds.) , John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448) . Ahora se entiende que estos efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano son un resultado de la presencia de dinucleotidos CpG no metilados, en particular contextos de bases (motivos CpG) , que son comunes en el ADN bacteriano, pero metilados e insuficientemente representados en ADN de vertebrados (Krieg et al, 1995) . Los efectos inmunoestimuladores del ADN bacteriano pueden ser imitados con oligodesoxinucleotidos (ODN) sinteticos que contienen estos motivos CpG. Tales ODN con CpG tienen efectos altamente estimuladores en leucocitos humanos y murinos, que inducen la proliferacion de las celulas B; la secrecion de citoquinas y de inmunoglobulinas; la actividad litica de los linfocitos citoliticos naturales (NK) y la secrecion del IFN-gamma; y la activacion de las celulas dendriticas (DCs) y otras celulas que presentan antigenos para expresar moleculas coestimualdoras y secretar las citoquinas, especialmente las citoquinas de tipo Th1 que son importantes en la promocion del desarrollo de respuestas de celula T de tipo Th1. Estos efectos inmunoestimuladores del ODN con CpG con esqueleto fosfodiester nativo son altamente especificos para CpG porque se reducen drasticamente los efectos si el motivo CpG se metila, se cambia por un GpC, o de otra manera se elimina o se altera (Krieg et al, 1995 and Hartmann et al, 1999) .

En los estudios primarios, se penso que el motivo CpG inmunoestimulador cumple con la formula purina-purinaCpG-pirimidina- pirimidina (Krieg et al, 1995; Pisetsky, 1996 and Hacker et al., 1998) .

Actualmente existe una cantidad significativa de los datos publicados que indican que los oligonucleotidos que contienen motivos CpG inducen ciertas citoquinas, por ejemplo, las celulas de raton y humanas responden a los oligonucleotidos con motivo CpG por un aumento de la secrecion del interferon-gamma (IFN-gamma) (Iho et al.,

1999: Cowder y et al., 1996) IL-1, IL-6, TNF-alfa e IL-12 (Stacey et al., 1996; Jakob et al., 1998 and Sparwasser et al., 1998) .

Debido a la naturaleza de las citoquinas inducidas, se considera ampliamente que los oligonucleotidos que contienen CpG inducen un perfil de Th1 tanto in vitro como in vivo (Zimmermann et al., 1998; Kline, 2000) .

Ademas de la presencia de los motivos CpG, los investigadores tambien han observado que sintetizando los oligonucleotidos con un esqueleto de fosforotioato (PS) resistente a la nucleasa completo, pueden potenciar los efectos estimuladores de los oligonucleotidos, porque estos oligonucleotidos fueron mucho mas potentes en las celulas B estimulantes, mientras que la misma secuencia con esqueleto fosfodiester nativo no tuvo ningun efecto (Zhao et al., 1996) . Mientras que la presencia de un motivo CpG dentro de la secuencia de un oligonucleotido puede inducir una fuerte respuesta de la citoquina Th1, esta respuesta debe ser considerada en el contexto general de los compuestos del estado de modificacion quimica asi como la estructura de la secuencia general.

Como ya se indico en la introduccion de los antecedentes a la inflamacion, existe un perfil de citoquinas especifico que se hace prominente en varios tipos de enfermedades inflamatorias. Por ejemplo en pacientes asmaticos existen altos niveles de IL-4 y bajos niveles de IFN-gamma. Esta descripcion de citoquinas indicara que el asma es un tipo Th2 de enfermedad. La artritis reumatoide por el contrario se asocia mejor con un tipo Th1 de la inflamacion caracterizadoºoorueese observan niveles altos de IFN-gamma y niveles bajos de IL-4.

El fenomeno de resistencia a los corticosteroides se ha estudiado mas extensamente en pacientes asmaticos y en menor grado en colitis ulcerosa donde la evidencia se ha acumulado a lo largo de los aros, lo que apunta a un numero de anormalidades de la citoquinas. Ambas enfermedades se clasifican como de tipo Th2 y se han implicado los interferones asi como IL-10 como factores importantes en la patogenesis de la resistencia a los corticosteroides.

Puede ser posible que los oligonucleotidos inmunoestimuladores que son capaces de inducir la produccion endogena de tales citoquinas, tales como interferones e IL-10, sean capaces de influenciar el estado inflamatorio de pacientes con resistencia a esteroides o dependientes de los esteroides de manera beneficiosa.

La evidencia de que ciertas citoquinas pueden influenciar la capacidad de respuesta a los esteroides se deduce de los estudios clinicos realizados en asmaticos resistentes a los corticosteroides y pacientes con colitis ulcerosa que tambien estaban todos en terapias con corticosteroides. De hecho, este tipo de caracteristica del subgrupo de pacientes fue el unico denominador comun entre los estudios clinicos descritos a continuacion.

Los interferones (IFNs) juegan papeles cruciales en la regulacion de una amplia variedad de respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los interferones de tipo I (IFN-alfa/beta) son fundamentales para la defensa del huesped contra patogenos tales como virus, mientras que el interferon de tipo II (IFN-gamma) principalmente contribuye con la regulacion mediada por la celula T de las respuestas inmunes (Taniguchi and Takaoka, 2001) . Los interferones tambien han encontrado su lugar en el tratamiento exitoso de diferentes enfermedades humanas tales como neoplasia benigna (Gill et al, 1995) y enfermedades virales (Niederau et al, 1996; Zeuzem et al, 2000) .

En un estudio (Simon et al, 2003) , 10 pacientes con asma resistente a los corticosteroides donde se les administro IFN-alfa (3x106 IU/dia) (Roferon A® Roche) ademas de la... [Seguir leyendo]

1. Uso de un oligonucleotido que tiene la secuencia 5'-Xm-GTTCGTC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 17) para la fabricacion de un medicamento para potenciar la eficacia de los esteroides en un paciente refractario a

esteroides, afectado por una condicion inflamatoria que no responde o responde poco o de manera inadecuada a un tratamiento anti-inflamatorio, en donde X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G, m=0-6, n=0-6 y en donde al menos un dinucleotido CG no es metilado y dicho oligonucleotido tiene de 8 a 100 acidos nucleicos de longitud.

2. Uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el oligonucleotido tiene entre 8 y 40 acidos nucleicos de longitud.

3. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia

5'-Xm-AGTTCGTCC-Yn-3' (SEQ. ID. No. 16)

y en donde m=0-5 y n=0-5.

4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia 5'-Xm-CAGTTCGTCCA-Yn-3' (SEQ. ID. No. 15)

y en donde m=0-4 y n=0-4.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia

5'-Xm-ACAGTTCGTCCAT-Yn-3' (SEQ. ID. No. 14) y en donde m=0-3 y n=0=3.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia

5'-Xm-AACAGTTCGTCCATG-Yn-3' (SEQ. ID. No. 13) y en donde m=0-2 y n=0-2.

7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia

5'-Xm-GAACAGTTCGTCCATGG-Yn-3' (SEQ. ID. No. 12) y en donde m=0-1 y n=0-1.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el oligonucleotido tiene la secuencia

5'-GGAACAGTTCGTCCATGGC-3' (SEQ. ID. No.1)

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho paciente esta actualmente en un tratamiento con esteroides.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho paciente esta actualmente en un tratamiento anti-inflamatorio.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la condicion inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de colitis ulcerosa (UC) , enfermedad de Crohn (CD) , artritis reumatoide, psoriasis, enfisema, asma y enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) .

12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho oligonucleotido comprende al menos un nucleotido que tiene una modificacion del esqueleto y dicha modificacion ocurre en uno o mas nucleotidos en cualquier posicion a lo largo de la longitud total de dicho oligonucleotido.

13. Uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde la modificacion es una modificacion del esqueleto de fosfato 5 seleccionado del grupo que consiste de una modificacion fosforotioato y una fosforoditioato.

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho oligonucleotido tiene de un oligonucleotido compuesto de ADN o un analogo o imitador de ADN seleccionado de metilfosfonato, N3'->P5'fosforamidato, morfolino, acido nucleico peptidico (PNA) , acido nucleico bloqueado (LNA) , acido nucleico con arabinosilo (ANA) , acido nucleico con fluoro-arabinosilo (FANA) , acido nucleico con metoxi-etilo (MOE) .

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el oligonucleotido va a ser administrado en combinacion con los esteroides.

ºiºera 1

ºiºera 2

ºiºera 3

ºiºera º4A

ºiºera º4º

ºiºera º4C

ºiºera 5

ºiºera 6

ºiºera 7 ºiºera 8

ºiºera º9A

ºiºera º9º

ºiºera º10A

ºiºera º10º