Un método in vitro para escrutar en búsqueda de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vpsp

a) proporcionar un ensayo para medir la unión de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p,

b) añadir el compuesto que va a ser evaluado al ensayo, y

c) determinar la cantidad de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina ligada al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, y

d) comparar la cantidad determinada en la etapa c) con una cantidad medida en ausencia del compuesto que va a ser evaluado,

e) en donde una diferencia entre las dos cantidades identifica un compuesto que altera la unión de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

Modulación de la actividad de neurotrofinas; método de escrutinio.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método in vitro para realizar el escrutinio de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

Antecedentes de la invención

La familia de las neurotrofinas Las neurotrofinas son hormonas peptídicas diméricas. El primer miembro de la familia de las neurotrofinas que se descubrió fue el factor de crecimiento de nervios (NGF, del inglés "nerve growth factor") , que desempeña un papel importante en procesos tales como el desarrollo de neuronas sensoriales y simpáticas en el sistema nervioso periférico (Levi-Montalcini, R. y Angeleeti, P.U., Physiol. Rev. 48, 534-569 (1968) ) . El siguiente miembro de la familia de las neurotrofinas que se aisló fue el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, del inglés "brain-derived neurotrophic factor") , también denominado neurotrofina-2 (NT-2) , la secuencia fue publicada por Leibrock, J. y col. en 1989 (Nature 341, 149-152) . En 1990 varios grupos identificaron un factor neurotrófico denominado originalmente factor neuronal (NF) , ahora denominado neurotrofina-3 (NT-3) (Ernfors y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 54545458 (1990) ; Hohn y col., Nature 344, 339; Maisonpierre y col., Science 247, 1446; Rosenthal y col., Neuron 4, 767; Jones y Reichardt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8060-8064; Kaisho y col., FEBS Lett. 266, 187) . A continuación se añadieron las neurotrofinas 4 y 5 a la familia (Neuron 6, 845-858 (1991) ; Berkmeier, L.R. y col., Neuron 7, 857-866 (1991) ; Ip y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3060-3064 (1992) ) .

Receptores de la familia de neurotrofinas De modo similar a otros factores de crecimiento polipeptídicos, las neurotrofinas afectan a sus células diana mediante interacciones con receptores de la superficie celular. Según el conocimiento que se tiene actualmente, las neurotrofinas se unen a dos tipos de receptores discretos que pueden distinguirse farmacológicamente: los receptores de neurotrofina Trk y p75NTR. El p75NTR es un miembro de la familia de receptores de Fas/factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés "tumour necrosis factor") , y puede interactuar con todos los miembros mamíferos de la familia de las neurotrofinas con afinidades iguales (Rodriguez-Tebar y col. 1990, Neuron 4: 487-492; Barker y Murphy, 1992, Mol. Cell. Biochem. 100: 1-15) . Las células que expresan TrkA, un receptor de tirosina quinasa identificado originalmente como oncogén humano (Mltin-Zanca y col., Nature 319: 743-748) se une únicamente a NGF y exhibe una cinética de disociación significativamente más lenta (Jing y col. 1992, Neurol. 9: 1067-1079; Loeb y Greene, 1993, Neuroscience 13: 2919-2929) . El BDNF se une al receptor TrkB únicamente, pero la NT-3 puede unirse a los tres receptores Trk (A, B y C) , mostrando preferencia por el TrkC. Las NT 4/5 se pueden unir a TrkA y a TrkB (Ip y col., PNAS 89: 3060-3064; Klein y col. Neuron 9: 947-956) . La NT-7 no interacciona con el TrkB o el TrkC pero sin embargo puede inducir la fosforilación de tirosina del TrkA, lo que indica una especificidad de receptor similar a la del NGF (Nilsson y col., FEBS Lett (1998) 13 Marzo; 424 (3) : 285-90) . La NT-6 recombinante purificada también presenta un espectro de acciones similares al NGF pero con una menor potencia (Gotz y col., Nature (1994) 17 Noviembre; 372 (6503) : 266-9) .

Familia de neurotrofinas: proteínas precursoras La biología de la familia de las neurotrofinas es compleja: las neurotrofinas se sintetizan intracelularmente como proteínas precursoras de 30-35 kDa, que contienen un péptido señal y posiciones de glicosilación. Durante el procesado, las proteínas precursoras también son divididas en una posición de ruptura básica por acción de la serina proteasa dependiente de calcio furina y otros miembros de la familia de las prohormona convertasas, dentro del aparato de Golgi. La parte N-terminal de esta ruptura es la neurotrofina madura de 118-120 aminoácidos y una producto C-terminal de 12-14 kDa biológicamente activo (Seidah y col., Biochem. J. (1996) 314: 951-960) .

Funciones clínicamente relevantes de la familia de las neurotrofinas Las neurotrofinas presentan interés clínico porque desempeñan un papel importante en la supervivencia y diferenciación de células neuronales (Thoenen 1991, Trends Neurosci. 14: 165-170; Raffioni y col. 1991, Ann. Rev. Biochem. 62: 823-850; Chao, 1992, Neuron 9: 583-593; Barbacid 1993, Oncogene 8: 2033-2042) . Los receptores Trk transmiten señales que promocionan la supervivencia neuronal, mientras que el p75NTR puede inducir la apoptosis neuronal así como la supervivencia neuronal que depende de cualquier co-expresión de TrkA (Miller y col., Cell. Mol. Life Sci. 58: 1045-1053 (2001) ) . Ciertamente, se ha demostrado que la activación de receptores TrkA puede negar el efecto pro-apoptótico del p75NTR (Yoon y col., J. Neurosci. (1998) 18: 3273-3281) .

Es probable que los pro-péptidos de las neurotrofinas desempeñen importante funciones biológicas: al menos una proteína precursora de neurotrofina (proNGF) y su producto procesado proteolíticamente y la contrapartida madura (NGF) activan diferencialmente respuestas celulares pro- y anti-apoptóticas a través de la activación preferencial de los receptores p75NTR y Trk, respectivamente (presentando la pro-NGF una mayor afinidad por los receptores p75NTR y una menor afinidad por los receptores Trk que las formas maduras de NGF) . De hecho, se ha demostrado que la pro-NGF induce la apoptosis dependiente de p75NTR en neuronas cultivadas con una activación mínima de la diferenciación o la supervivencia mediada por TrkA (Lee y col., Science (2001) , 294: 1945-1948) .

Además, las neurotrofinas presentan interés clínico porque se sabe que se produce simultáneamente una regulación al alza de neurotrofinas y un aumento de la expresión de p75NTR en condiciones patológicas e inflamatorias, especialmente tras una lesión nerviosa y daño en el sistema vascular. De hecho, Soilu-Hanninen y col. han demostrado que las funciones apoptóticas del p75NTR están implicadas directamente en la apoptosis inducida por una lesión (Soilu-Hanninen y col., J. Neurosci. 19: 4824-4838 (1999) ) . Recientemente, también se ha demostrado que la pro-NGF induce la muerte mediada por p75 de oligodendrocitos después de una lesión de médula espinal (Beatty y col., Neuron (2002) , vol. 39, pág. 375-386) .

Se ha presentado la hipótesis de que la carencia de factores neurotróficos es la responsable de la degeneración de poblaciones neuronales selectivas, ya que se produce en la enfermedad de Parkinson, en la enfermedad de Alzheimer y en la esclerosis lateral amiotrófica, y que la aplicación del correspondiente factor neurotrófico podría prevenir la degeneración neuronal [Appel, S.H., "A unifying hypothesis for the cause of amyotrophic lateral sclerosis, parkinsonism, and Alzheimer's disease", Ann. Neurol. 10: 499-505 (1981) ]. En particular, como el NGF es un factor trófico para la población de neuronas colinérgicas basales del cerebro anterior que se degeneran en la enfermedad de Alzheimer, se ha especulado con que el NGF puede ser útil en el tratamiento de esta enfermedad.

Otra razón para el interés en los mecanismos de terapia con neurotrofinas es que los estudios realizados han proporcionado evidencias sólidas sobre la implicación de las neurotrofinas en la depresión y la acción antidepresiva (Duman y col., Arch Gen Psychiatr y (1997) 54: 597-606) ; por ejemplo la infusión de BDNF en el hipocampo ha producido un efecto antidepresivo en dos modelos de comportamiento de la depresión (Shirayama y col. (2002) , J Neurosci 22 (8) : 3251-3261) .

La familia de receptores con dominio Vps10p

La sortilina (o NTR-3 ó GP95) es un receptor de membrana de tipo I que se expresa en una serie de tejidos, incluyendo el cerebro, la espina dorsal, los testículos y el músculo esqueletal (Petersen y col., J. Biol. Chem., 272: 3599-3605 (1997) ; Herman-Borgmeyer y col., Mol. Brain Res., 65: 216-219 (1999) ) . La sortilina pertenece a una familia de receptores que comprenden sortilina, SorLA (Jacobsen y col., J. Biol. Chem., 271: 31379-31383 (1996) ) , SorCS1, SorCS2 y SorCS3. Todos los receptores de esta familia comparten la característica estructural de un dominio N-terminal de aproximadamente 600 aminoácidos con una fuerte semejanza con los dos dominios que constituyen la porción luminal del receptor de clasificación de levadura Vps10p (Marcusson, E.G. y col., Cell, 77: 579-586 (1994)... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para escrutar en búsqueda de un compuesto que altere la unión de al menos una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina con un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p 5 a) proporcionar un ensayo para medir la unión de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina a un receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, b) añadir el compuesto que va a ser evaluado al ensayo, y c) determinar la cantidad de una neurotrofina y/o una pro-neurotrofina ligada al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p, y 10 d) comparar la cantidad determinada en la etapa c) con una cantidad medida en ausencia del compuesto que va a ser evaluado, e) en donde una diferencia entre las dos cantidades identifica un compuesto que altera la unión de neurotrofinas y/o pro-neurotrofinas al receptor de la familia de receptores con dominio Vps10p.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pro-neurotrofina se selecciona entre pro-NGF o pro15 BDNF, pro-NT-3 o pro-NT-4/5.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el receptor se selecciona entre SorLa, Sortilina, SorCS1, SorCS3 o SorCS2.