Microsensor para la detección de D-aminoácidos.

Microelectrodo para medir la concentración de un D-aminoácido,

comprendiendo dicho microelectrodo:

- al menos una D-aminoácido oxidasa (DAAO) de una levadura o un microorganismo, para la oxidación de dicho Daminoácido en al menos un compuesto B,

- medios para optimizar la detección de dicho compuesto B, siendo dichos medios medios para la catálisis de la oxidación del compuesto B, y

- medios para reducir las interferencias debidas a la oxidación de otras especies diferentes del compuesto B, en donde los medios para reducir las interferencias son limitar la oxidación de los compuestos diferentes del compuesto B que puede oxidarse mediante el electrodo.

Microsensor para la detección de D-aminoácidos

La presente invención se refiere al campo de los microsensores o microdispositivos de detección.

Más precisamente, la invención se refiere a un microsensor o microelectrodo para medir la D-serina y un método electroquímico para detectar y/o medir D-aminoácido, en particular D-serina, más específicamente in vitro, ex vivo y/o in vivo.

Hay una necesidad especial de sensores de D-aminoácidos que se puedan usar oara mediciones in vivo. Por ejemplo, para la D-serina, que recientemente ha mostrado que está presente en el Sistema Nervioso Central (SNC) , en el córtex, , hipocampo o cerebelo en desarrollo.

Este D-aminoácido ha estado implicado recientemente en varias patologías, tales como esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, dolor crónico o isquemia cerebral. Hay por tanto una necesidad de agentes farmacológicos capaces de interferir con el sistema de síntesis, liberación, catabolismo y/o captación de la D-serina en el SNC, así como de métodos fiables para detectar D-serina in vivo e in vitro.

Un método conocido de para medir la concentración extracelular de la D-serina es la microdiálisis. Este método es pesado, caro y difícil de emplear. Además, implica el uso de sondas relativamente grandes, lo que puede provocar lesiones que pueden comprometer la medición.

Además, el principio de este método por sí mismo, que comprende las etapas de diálisis del medio extracelular, recogida y análisis de su contenido, puede provocar una perturbación de la funcionalidad fisiológica de la muestra debido a la circulación de fluido exógeno extracelular, que puede cambiar la concentración local de la D-serina, así como de otros metabolitos pequeños.

También son conocidos métodos electroquímicos para detectar la D-serina, por ejemplo en la industria alimentaria. Estos métodos usan sensores que tienen un tamaño milimétrico o centrimétrico, que generalmente no es compatible con un uso in vivo use.

El campo de los microsensores es de un interés creciente. Hay así una necesidad general de sensores fiables, baratos, pequeños, precisos, selectivos y/o versátiles y más particularmente de sensores que se puedan usar in vivo y/o que permitan medir en tiempo real los cambios en la concentración de un compuesto.

El documento EP1542017 se refiere a un método de examen o diagnosis de la esquizofrenia mediante la medición de la concentración de la D-Serina por cromatografía.

Johanssonn et al. (J. of Biomaterials Application, vol 8, p. 146-173, 1993) describe un biosensor constituido por un electrodo de 1, 7 mm de dámetro modificado con D-aminoácido oxidasa y ya sea peroxidasa de rábano picante o peroxidasa fúngica.

Qijin Chi et al (Analytica Chimica Acta, vol 310, p. 429-436, 1995) describe un biosensor amperométrico mediante la incorporación de D-amino oxidasa en una película de azul de Prusia durante el proceso de crecimiento electroquímico y la deposición electroquímica sobre un microelectrodo de grafito de 7 mm de diámetro basal.

Como se ha discutido anteriormente, hay una necesidad especial de un dispositivo para detectar D-aminoácidos, y en particular D-serina, in vivo y/o permitiendo medir su concentración en tiempo real, por ejemplo, para desarrollar un método para encontrar agentes farmacológicos capaces de interferir en la síntesis, liberación y/o eliminación de D-aminoácidos, y más específicamente D-serina en el sistema nervioso central (SNC) .

Siguiendo un tercer aspecto, el objeto de la invención es un microelectrodo, en particular para medir la concentración de un D-aminoácido, comprendiendo dicho microelectrodo:

• medios para la oxidación de dicho D-aminoácido en al menos un compuesto B,

• medios para optimizar la detección de dicho compuesto B, y

• medios para reducir interferencias, en particular interferencias debidas a la oxidación de otras especies distintas del compuesto B.

El microelectrodo de la invención puede tener un límite de detección de 300 nM o menor del D-aminoácido de interés, en particular D-serina.

El microelectrodo presenta una buena selectividad. Por ejemplo, las disoluciones de serotonina, dopamina, L-serina y glicina a 10 µM (concentraciones mucho mayores que las concentraciones fisiológicas de estas moléculas) , no generan señales mayores que el 5% de las detectadas a la misma concentración de D-serina.

La Figura 1 muestra un ejemplo de experimento en donde se han inyectado 200 nM de peróxido de hidrógeno en la cámara de registro. La inyección produce un escalón en la corriente de oxidación en el electrodo de trabajo.

La figura 2 muestra la calibración del microelectrodo de la invención en cantidades en aumento de peróxido de hidrógeno. La respuesta del microelectrodo es lineal con concentraciones entre 10 nM y al menos 10 µM de peróxido de hidrógeno.

La figura 3 A y B muestra la detección de D-serina usando el microelectrodo de la presente invención.

La figura 3 A muestra el registro de oxidación (nA) que se produce en el microelectrodo de la invención con el tiempo

(s) y la aplicación de serotonina (5-HT, 20 pM) , peróxido de hidrógeno (H2O2, 1 µM) , y D-serina (1 µM y 2 µM) . La Dserina y H2O2 se detectan como un escalón en la corriente de oxidación, y es rechazada la interferencia de 5-HT.

La figura 3 B muestra la curva de calibración de un microelectrodo de la presente invención a concentraciones de Dserina que van de 5 µM a 1, 2 mM.

La figura 4 muestra un ejemplo de liberación de D-serina por astrocito en un cultivo después de la aplicación de digitonina. Se añadieron 50 µM de digitonina a las células en el cultivo. El microelectrodo de la presente invención, colocado por encima de las células detecta la liberación de D-serina debida a la rotura de ka membrana celular de los astrocitos.

La figura 5 A, B y C muestra la excelente selectividad del microelectrodo de la presente invención.

La figura 5 A es un cromatograma típico que muestra una curva de intensidad de fluorescencia (µV) frente al tiempo (min) . Muestra un pico de D-serina de ejemplo después de 12 min de tiempo de elución y su desaparición después de la incubación, con D-Aminoácido Oxidasa de Rhodotorula gracilis (RgDAAO) y catalasa.

La figura 5 B muestra un ejemplo de la respuesta de la corriente registrada en el microelectrodo de la presente invención después de la adición de un extracto de cerebro (dilución X40) y 3 µM de D-serina (corriente de oxidación en pA frente al tiempo en s) . La respuesta de la corriente a un extracto de cerebro preincubado en RgDAAO y catalasa se redujo enormemente en comparación a la de un extracto de cerebro de control. La figura 5 C es un diagrama que muestra los resultados resumidos de la comparación entre la concentración de D-serina estimada mediante HPLC y el microelectrodo de la presente invención.

Por "microelectrodo" en la presente invención se quiere indicar un electrodo de pequeño tamaño, en particular un electrodo que tiene un diámetro medio de menos de 1 mm, especialmente de menos de 500 µm, más particularmente de menos de 250 µm, especialmente de menos de 150 µm y más específicamente de menos de 100 µm, o incluso menos de 50 µm.

La definición de un "microelectrodo" según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada es como se indica a continuación: "microelectrodo es cualquier electrodo cuya dimensión característica es, en condiciones experimentales dadas, comparable o más pequeño que el espesor de la capa de difusión." Stulik K, Amatore C, Holub K, Marecek V y Kutner W (2000) Microelectrodes. Definitions, characterization and applications (technical report) . Pure Appl. Chem. 72: 1483-92. [1]

Los medios de oxidación de los D-aminoácidos pueden ser al menos una D-aminoácido oxidasa (DAAO) , en particular una D-aminoácido oxidasa que condice a la producción de peróxido de hidrógeno como compuesto B.

Una D-aminoácido oxidasa (DAAO) puede ser flavoenzima que contiene una molécula de flavina adenina dinucleótido unido covalentemente o no covalentemente como cofactor, que es el sitio de la reacción rédox

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1. Microelectrodo para medir la concentración de un D-aminoácido, comprendiendo dicho microelectrodo:

- al menos una D-aminoácido oxidasa (DAAO) de una levadura o un microorganismo, para la oxidación de dicho Daminoácido en al menos un compuesto B,

- medios para optimizar la detección de dicho compuesto B, siendo dichos medios medios para la catálisis de la oxidación del compuesto B, y

- medios para reducir las interferencias debidas a la oxidación de otras especies diferentes del compuesto B, en donde los medios para reducir las interferencias son limitar la oxidación de los compuestos diferentes del compuesto B que puede oxidarse mediante el electrodo.

2. Microelectrodo según la reivindicación 1, en donde dicha D-aminoácido oxidasa conduce a la producción de peróxido de hidrógeno como el compuesto B.

3. Microelectrodo según cualquiera de la reivindicación 1 ó 2, en donde la D-aminoácido oxidasa (DAAO) no necesita la adición de un cofactor en el medio para oxidar el D-aminoácido y/o muestra una actividad de al menos 20 unidades/mg.

4. Microelectrodo según la reivindicación 1, en donde dicha DAAO se selecciona del grupo que comprende Rhodotorula gracilis DAAO (RgDAAO) , Trigonopsis variabilis DAAO, V. luteoalbum DAAO, F. oxysporum DAAO y sus derivados.

:. Microelectrodo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el D-aminoácido se selecciona del grupo que comprende D-alanina, D-valina, D-leucina, D-isoleucina, D-metionina, D-prolina, D-fenilalanina, D-triptofan, Dserina, D-treonina, D-tirosina, D-cisteína, D-asparagina, D-glutamina, D-lisina, D-arginina y D-histidina, y sus derivados.

:. Microelectrodo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el D-aminoácido es D-serina.

:. Microelectrodo según cualquiera de reivindicaciones 1 a 6, en donde los medios para la oxidación del Daminoácido es inmovilizarlo sobre el electrodo mediante:

- Inmovilización covalente,

- Atrapar la D-aminoácido oxidasa (DAAO) ,

- Inmovilización en el cuerpo del electrodo, y/o

- Adsorción.

8. Microelectrodo según cualquiera de reivindicaciones 1 a 7, en donde los medios para optimizar la detección de dicho compuesto B se seleccionan de :

- un pretratamiento electroquímico del electrodo,

- deposición de al menos un metal

- deposición de un sistema artificial que cataliza la oxidación del compuesto B,

- peroxidasa de rábano picante (HRP) ,

- uso de nanopartículas, y

- una combinación de los mismos.

9. Microelectrodo según la reivindicación 8, en donde

- dicho electrodo es un electrodo basado en carbono,

- dicha deposición es una deposición electroquímica o a vacío de un metal que cataliza la oxidación del compuesto B,

- dicho sistema artificial es un sistema artificial de peroxidasa basado en azul de Prusia.

10. Microelectrodo según reivindicación 8 ó 9, en donde el metal se selecciona del grupo que comprende platino, oro, rutenio, rodio, paladio, iridio, osmio, hierro, cromo, níquel y wolframio.

11. Microelectrodo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde los medios para reducir las interferencias son a través de limitar el acceso y/o el contacto de dichos compuestos distintos del compuesto B con el electrodo.

12. Microelectrodo según cualquiera de reivindicaciones 1 a 11, en donde los medios para reducir las interferencias se seleccionan de

- membranas poliméricas electrogeneradas,

- membranas depositadas de disoluciones de polímeros neutros o cargados,

- capa molecular no polimérica cargada,

- uso de al menos una enzima que degrada la (s) molécula (s) que interfiere (n) , y

- uso de métodos electroquímicos que permiten discriminar entre diferentes moléculas.

13. Microelectrodo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el electrodo se elige del grupo que comprende:

- electrodos basados en platino, rodio, paladio, oro, rutenio

- electrodos basados en materiales de carbono, grafito y carbono brillante, fibras de carbono, diamante,

- electrodos cubiertos por nanopartículas basados en metales nobles, materiales de carbono o una mezcla de los mismos, y

- electrodos amperométricos basados en cerámica.

14. Microelectrodo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el microelectrodo es un electrodo de fibra de carbono cubierto por una capa de rutenio, una capa de PPD y una capa de D-aminoácido oxidasa (DAAO) .

1:. Dispositivo para detectar y/o para medir la concentración de un D-aminoácido en un medio, que comprende un electrodo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

1:. Método para detectar y/o medir la concentración de un D-aminoácido en un medio in vitro que comprende las etapas siguientes:

- un microelectrodo de trabajo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 se coloca en dicho medio,

- se aplica un potencial de trabajo, y

- la concentración del D-aminoácido se detecta y/o se mide.

1:. Método según la reivindicación 16, en donde el potencial de trabajo se aplica mediante voltametría cíclica, voltametría/amperometría pulsada o aplicando un potencial constante.

18. Método para obtener un microelectrodo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que comprende las etapas siguientes:

- tratar el electrodo para aumentar su sensibilidad al compuesto B,

- la deposición de una película polimérica para discriminar el compuesto B de otros compuestos presentes en el medio y que pueden ser oxidados por el electrodo,

- la deposición de una película de una enzima que oxida el compuesto A al compuesto B en el electrodo, y después inmovilizar dicha enzima.

19. Método según la reivindicación 18, en donde el electrodo se trata mediante una metalización.