Métodos y composiciones.

Complejo que comprende una partícula de fago, comprendiendo dicha partícula de fago

(i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido;



(ii) el polipéptido expresado por el ácido nucleico de (i) y expuesto en la superficie del fago;

(iii) un compuesto conector unido a dicho polipéptido

en el que dicho compuesto conector está unido al polipéptido mediante al menos tres enlaces covalentes independientes.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2009/000301.

Solicitante: MEDICAL RESEARCH COUNCIL.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 2nd Floor, David Phillips Building Polaris House, North Star Avenue Swindon, SN2 1FL REINO UNIDO.

Inventor/es: HEINIS,CHRISTIAN, WINTER,GREGORY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K47/48
  • C07K1/107 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › por modificación química de los péptidos precursores.
  • C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C40B30/04 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 30/00 Procedimientos de selección de bibliotecas. › midiendo la capacidad para unirse específicamente a una molécula diana, p. ej. unión anticuerpo-antígeno, unión receptor-ligando.
  • C40B40/02 C40B […] › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas contenidas en o exhibidas por microorganismos, p. ej. bacterias o células animales; Bibliotecas contenidas en o exhibidas por vectores, p. ej. plásmidos; Bibliotecas que únicamente contienen microorganismos o vectores.
  • C40B40/08 C40B 40/00 […] › Bibliotecas que contienen ARN o ADN que codifican proteínas, p. ej. genotecas.
  • C40B50/06 C40B […] › C40B 50/00 Procedimientos de creación de bibliotecas, p. ej. síntesis combinatoria. › Procedimientos bioquímicos, p. ej. empleando enzimas o microorganismos enteros viables.
  • G01N33/569 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
  • G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

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Fragmento de la descripción:

Metodos y composiciones

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se refiere a la modificacion y al constrenimiento de polipeptidos, en particular a polipeptidos codificados 5 geneticamente en complejos con un acido nucleico que los codifica tal como en el contexto de la exposicion en fagos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La generacion de las moleculas con afinidad y especificidad elevadas por las dianas biologicas es un problema central en la quimica, en la biologia y en las ciencias farmaceuticas. En particular, los ligandos de fijacion son

importantes para la creacion de farmacos que son capaces de interferir con los procesos biologicos. La creacion de ligandos que se fijan a un ligando diana elegido suele implicar un proceso de generacion de una coleccion de posibles moleculas de fijacion y el ensayo de las propiedades de fijacion de dichas moleculas.

Mientras que las tecnicas biologicas de seleccion in vitro se utilizaron eficazmente para aislar grandes estructuras biopolimericas, tales como anticuerpos, hasta la fecha eran menos practicables para el aislamiento de farmacos que 15 fueran moleculas pequenas. Las tecnicas biologicas de seleccion in vitro se limitan por lo general a polimeros biologicos tales como polipeptidos, ARN o ADN. Los biopolimeros pequenos como, por ejemplo, los peptidos, tambien se pueden fijar a dianas biologicas, pero pueden carecer de flexibilidad conformacional y pueden ser propensos a la degradacion proteolitica en los liquidos corporales. Ademas esta la debilidad de la afinidad de union de los peptidos lineales pequenos. Se conocen diferentes estrategias de circularizacion para constrenir las 20 genotecas de peptidos pequenos codificados geneticamente. Se sabe que los repertorios de peptidos expuestos en fagos, por ejemplo, se circularizan mediante la oxidacion de dos restos de cisteina flanqueantes. Se sabe que las genotecas de peptidos ciclicos codificados por ARNm se generan al formar un enlace entre la amina aminoterminal y un resto de lisina del peptido con un reactivo de entrecruzamiento quimico. Esta estrategia se utilizo para aislar macrociclos insensibles a la oxido-reduccion que se fijan a la proteina de senalizacion G±i1 (Millward, S. W. et al., 25 ACS Chem. Biol., 2007) . Tambien se conocen diferentes estrategias para uso en la incorporacion de bloques de construccion no naturales en genotecas de polipeptidos codificados geneticamente para expandir la diversidad de las genotecas o para insertar propiedades que no pueden proporcionar los aminoacidos naturales. Sin embargo, las estrategias permitieron solo la adicion de un numero limitado de anadidos organicas pequenos a los polipeptidos lineales codificados geneticamente. Frankel, A. et al., por ejemplo, habian incorporado aminoacidos no naturales a 30 polipeptidos naturales que se codificaron mediante exposicion de ARNm (Frankel, A et al., Chem. Biol., 2003) . Jespers L. et al habian conectado quimicamente una molecula indicadora fluorescente a un lazo hipervariable de un repertorio de anticuerpos expuestos en fagos, y seleccionaron del repertorio los que se fijaban a antigenos (Jespers, L., et al., Prot. Eng., 2004) . Dwyer, M. A. et al habian juntado peptidos sinteticos a un repertorio de peptidos expuestos en fagos mediante la ligacion quimica nativa para la generacion de una coleccion de inhibidores de

proteasas que contenian un aminoacido no natural (Dwyer, M. A. et al., Chemistr y & Biology, 2000) . Tambien se han conectado moleculas organicas pequenas a repertorios combinatorios de peptidos codificados por ARNm. El equipo de investigacion de Roberts, R. W. habia pegado un resto de penicilina a una posicion fija de una genoteca de peptidos de exposicion de ARNm para seleccionar los inhibidores de la proteina 2a de fijacion a la penicilina en Staphylococcus aureus (Li, S y Roberts, W. R., Chem & Biol., 2003) .

Se han propuesto varias metodologias para aplicar la seleccion in vitro a colecciones combinatorias de compuestos que tienen arquitecturas moleculares mas diversas (p. ej., moleculas ramificadas) y que estan formadas por bloques de construccion no naturales. A diferencia de los metodos biologicos de seleccion in vitro, estas metodologias utilizan estrategias quimicas para pegar etiquetas de ADN a las moleculas organicas pequenas. Brenner S y Lerner R. A. habian propuesto un proceso de sintesis combinatoria paralela para codificar cada miembro de una gran quimioteca

45 con secuencias nucleotidicas unicas en perlas (Brenner, S. y Lerner, R. A., PNAS, 1992) . Despues de que la entidad quimica se fije a la diana, el codigo genetico se descodifica por secuenciacion de la etiqueta nucleotidica. Liu D. R. y colaboradores habian conjugado una pequena coleccion de moleculas organicas a oligonucleotidos de ADN y realizaron selecciones por afinidad con antigenos diferentes (Doyon, J. B. et al., JACS, 2003) . Neri D. y colaboradores habian generado grandes repertorios de parejas moleculares mediante el autoensamblaje de

50 subquimiotecas mas pequenas codificadas por ADN mediante la hibridacion de dos hebras de ADN (Melkko, S. et al., Nature Biotechnol., 2004) . La metodologia se utilizo con exito para la maduracion de la afinidad de los ligandos que son moleculas pequenas. Halpin D. R. y Harris P. B. desarrollaron una estrategia para la evolucion in vitro de quimiotecas combinatorias que implica la amplificacion de determinados compuestos para realizar varios ciclos de seleccion (Halpin, D. R. y Harbur y , P. B., PLOS Biology, 2004) . Woiwode T. F. et al pegaron colecciones de

55 compuestos sinteticos a las proteinas de la cubierta de las particulas de bacteriofago de tal forma que la identidad de la estructura quimica esta especificada en el genoma del fago (Woiwode, T. F., Chem. & Biol., 2003) . Todas estas estrategias que emplean entidades quimicas especificadas por ADN han resultado ser eficientes en experimentos modelo y algunos incluso han producido nuevas moleculas pequenas aglutinantes. Sin embargo, quedo muy claro que la codificacion de genotecas grandes de compuestos y la amplificacion de los compuestos seleccionados es mucho mas exigente que los procedimientos equivalentes en los sistemas biologicos de seleccion.

Jespers et al (2004, «Protein engineering design and selection», volumen 17, n.o 10, paginas 709-713) describen la seleccion de biosensores opticos a partir de colecciones de anticuerpos quimiosinteticos. Este documento trata de la union de una molecula indicadora fluorescente a traves del lazo hipervariable de un repertorio de anticuerpos expuestos en fagos. En particular, este documento describe la conexion de una molecula indicadora fluorescente en un lazo hipervariable (region determinante de la complementariedad o CDR) de un repertorio de anticuerpos

sinteticos. La molecula indicadora fluorescente esta conectada mediante un enlace covalente unico a un resto de cisteina introducido artificialmente en el lazo hipervariable. Se realiza la union del uno al otro. Los restos cisteina en las particulas de fagos se redujeron con DTT y se retiro el exceso del agente reductor mediante precipitacion convencional con polietilenglicol (PEG) como se conoce bien en la tecnica.

Dwyer et al describen la exposicion en fagos biosinteticos, que describe una nueva herramienta de ingenieria de

proteinas que combina la diversidad quimica y genetica. Dwyer et al (Chem. Biol. 2000, volumen 7, no. 4, paginas 2º3-274) describen la ligacion quimica de un peptido sintetico que tiene un aminoacido no natural a una coleccion de peptidos sinteticos que comprende los principales restos estructurales de una proteina de interes. La motivacion para realizar esto fue para generar un amplio abanico de secuencias de proteasas, y cada una contiene un segmento constante que incorpora un aminoacido no natural. El peptido sintetico que comprende el aminoacido no natural se

pego simplemente mediante ligacion quimica nativa, lo que da lugar al acoplamiento de los dos fragmentos peptidicos juntos. No se describe ningun compuesto conector. No se describe la adhesion de ninguna molecula pequena. No se consiguio ninguna constriccion ni restriccion conformacional del peptido resultante. No se describe ninguna formacion de enlaces covalentes entre determinados restos y la cadena polipeptidica.

Diferentes equipos de investigacion han sujetado previamente polipeptidos con restos de cisteina a una estructura

molecular sintetica (Kemp, D. S y McNamara, P. E., J. Org. Chem. 19º5º Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005) . Meloen y colaboradores habian utilizado tris... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Complejo que comprende una particula de fago, comprendiendo dicha particula de fago

(i) un acido nucleico que codifica un polipeptidoº

(ii) el polipeptido expresado por el acido nucleico de (i) y expuesto en la superficie del fagoº 5 (iii) un compuesto conector unido a dicho polipeptido

en el que dicho compuesto conector esta unido al polipeptido mediante al menos tres enlaces covalentes independientes.

2. Complejo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el compuesto conector tiene una simetria molecular que corresponde al numero de enlaces covalentes mediante los cuales se une al polipeptido.

3. Complejo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el compuesto conector posee simetria molecular ternaria y el compuesto conector esta unido al polipeptido mediante tres enlaces covalentes.

4. Complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto conector comprende un grupo quimico estructuralmente rigido.

5. Complejo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el compuesto conector comprende tris (bromometil) benceno 15 (TBMB) .

º. Complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho polipeptido comprende un resto de cisteina, y en donde al menos uno de dichos tres enlaces covalentes independientes para la union de dicho compuesto conector al polipeptido comprende un enlace a dicho resto de cisteina.

7. Genoteca de polipeptidos codificados geneticamente, que comprende al menos dos complejos diferentes de 20 acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

º. Metodo para fabricar un complejo, comprendiendo dicho metodo

(i) el aporte de una particula de fago que comprende un acido nucleico, y un polipeptido expresado por el acido nucleico y expuesto sobre la particula del fagoº

(ii) el aporte de un compuesto conector

(iii) la union de dicho compuesto conector a dicho polipeptido mediante la formacion de al menos tres enlaces covalentes entre dicho compuesto conector y el polipeptido.

9. Metodo de acuerdo con la reivindicacion º, en el que los grupos reactivos del polipeptido expuesto en la particula de fago estan reducidos, y en el que las particulas de fagos que exponen el polipeptido que comprende grupos reactivos reducidos se purifica por filtracion antes de la etapa (iii) .

10. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que despues de la etapa de purificacion por filtracion se mantiene el polipeptido en el estado reducido para formar un enlace con el compuesto conector mediante la incubacion en tampon desgasificado y en presencia de un quelante.

11. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 10, en el que la etapa (iii) comprende la

incubacion del polipeptido y del compuesto conector juntos a 30 oC a pH en tampon acuoso que comprende 35 acetonitrilo.

12. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 11, en el que el compuesto conector comprende tris- (bromometil) benceno (TBMB) .

13. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que el tris- (bromometil) benceno esta presente a 10 !M.

14. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que el quelante es el acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) , 40 el acetonitrilo esta presente al 20% y la etapa de incubacion (iii) se realiza durante 1 hora.

15. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones a 14, comprendiendo dicho metodo la etapa adicional de (iv) escindir uno o mas enlaces de la cadena polipeptidica.

1º. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que dicha etapa de escision comprende poner en contacto dicho polipeptido con una proteasa.

17. Complejo obtenido mediante el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones º a 1º.

1º. Metodo para identificar un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de fijarse a un ligando, comprendiendo el metodo

(i) el aporte de un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores

(ii) puesta en contacto de dicho complejo con el ligando, y

(iii) seleccion de los complejos que se fijan a dicho ligando.

19. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1º, que ademas comprende la determinacion de la secuencia del acido nucleico de dicho complejo.

20. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1º, que ademas comprende la etapa de fabricar el complejo aislado con capacidad para fijarse a dicho ligando.

21. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1º, que ademas comprende la etapa de fabricar un conjugado entre el compuesto conector y el polipeptido que se aisla o identifica mediante un metodo de la invencion, comprendiendo dicha fabricacion la union del compuesto conector al polipeptido, en donde dicho polipeptido se expresa

recombinantemente o se sintetiza quimicamente.

22. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 21, que ademas comprende la etapa de extender el polipeptido en uno o mas del extremo amino o del extremo carboxilo del polipeptido.

23. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, que ademas comprende la etapa de conjugar a un polipeptido adicional dicho conjugado de polipeptido y compuesto conector.

24. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 23, en el que dicha conjugacion se realiza

(i) anadiendo otra cisteina al polipeptido despues de enlazarse con el compuesto conector, y

(ii) conjugando dicho polipeptido a dicho polipeptido adicional mediante la formacion de puente disulfuro con dicha cisteina adicional.

lazo al lazo al azar 1 azar 2

secuencia lider peptido conector

Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM) :

Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM) :

Genoteca 2 Genoteca 3 Genoteca 4 secuencia lider peptido conector Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM) :

(maduración de la afinidad)

Concentracion del inhibidor (nM)

Actividad de tipo calicreina (pmol pNA/min ml)

Trombina (nM) Trombina (nM)

aprotinina

Tiempo (min) peptido PK15

Tiempo (min)

aprotinina peptido PK15

Concentracion de inhibidor (nM)

lazo al lazo al azar 1 azar 2

secuencia lider peptido conector

Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM) :

Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM) :

Genoteca 2 Genoteca 3 Genoteca 4 secuencia lider peptido conector Mutante: Secuencia de aminoacidos: CI50 (nM) :

Concentracion del inhibidor (nM)

º1

A

25424, º0 25310, 00

masa

25450, 202533º, 00

masa

masa

aprotinina peptido PK15

Concentracion de inhibidor (nM)


 

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