Métodos y sondas para detectar cáncer de esófago.

Un método para la detección de un carcinoma de esófago o una lesión precursora en un sujeto,

comprendiendo el método:

a) poner en contacto una muestra biológica que comprende células del esófago procedentes del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas, en donde dicho conjunto consiste en una sonda específica del locus 8q24.12-13, una sonda específica del locus 17q11.2-12, una sonda específica del locus 20q13 y una sonda específica del locus 9p21; y

b) detectar un patrón de hibridación para el conjunto de sondas cromosómicas con la muestra biológica, en donde el patrón de hibridación es indicativo de la presencia o ausencia de un carcinoma de esófago o de una lesión precursora.

Métodos y sondas para detectar cáncer de esófago Antecedentes de la invención Se estima que durante el año 2004 habrá en los Estados Unidos 14.250 nuevos casos de cáncer de esófago y aproximadamente 13.300 muertes por cáncer de esófago. Aproximadamente el 80% de estos tumores serán adenocarcinoma esofágico (AE) y el 20% restante será carcinoma de células escamosas. La mayoría, si no todos, los AE se cree que surgen en pacientes con esófago de Barrett (EB) , una afección preneoplásica causada por metaplasia de la mucosa escamosa normal del esófago distal, en mucosa intestinal especializada que contiene células caliciformes. El EB está causado por una enfermedad crónica por reflujo gastroesofágico (ERGE) , un trastorno que afecta a más de 20 millones de estadounidenses cada día. De seis a catorce por ciento de las personas con ERGE crónica desarrollará EB. La incidencia de AE en pacientes con EB se ha notificado que es aproximadamente del 0, 5% -1, 0% por año y el riesgo de por vida de cáncer para los pacientes con EB es aproximadamente del 5%.

Las etapas histológicas que conducen al adenocarcinoma de esófago en pacientes con EB son las siguientes: 1) metaplasia intestinal (MI) del epitelio escamoso estratificado normal, 2) displasia de bajo grado (DBG) , 3) displasia de alto grado (DAG) y 4) AE. Los pacientes con diagnóstico de EB deberían someterse a una vigilancia regular para el desarrollo de lesiones neoplásicas, incluyendo DBG, DAG y AE. Los pacientes con AE y DAG deben ser tratados de forma agresiva, ya sea con esofagectomía distal o terapias desarrolladas más recientemente, como la terapia fotodinámica u otras técnicas de ablación para prevenir la progresión a enfermedad metastásica e incurable. Los pacientes con DBG tienen el riesgo de evolucionar a DAG y, por lo tanto, requieren una vigilancia regular, pero no una esofagectomía. La supervivencia general de 5 años para los pacientes con AE es solo del 20%. Será necesaria una detección temprana y precisa y un tratamiento de los precursores neoplásicos de AE (es decir, MI, DBG y DAG) si va a haber un aumento en la tasa de supervivencia de pacientes con neoplasia asociada a EB.

Los resultados histológicos se consideran actualmente como la regla de oro para determinar si un paciente tiene displasia y/o AE. Actualmente se recomienda que en los pacientes con EB se vigile el desarrollo de DAG y AE mediante la realización de exámenes endoscópicos regulares del esófago y la obtención de biopsias en cuatro cuadrantes para cada 1-2 cm de esófago afectado. Sin embargo, esta recomendación no se sigue con frecuencia, debido principalmente a se requiere mucho tiempo para llevar a cabo este procedimiento, especialmente en pacientes con EB de segmento largo. Los problemas asociados con el uso de biopsias para el seguimiento del desarrollo de neoplasias en pacientes con Barrett, incluyen: 1) toma de muestras limitada de la mucosa afectada, 2) imposibilidad de tomar biopsias en cuatro cuadrantes cada 1-2 cm, y 3) mala reproducibilidad entre observadores de patologías para el diagnóstico de DBG y DAG. Se ha estimado que los protocolos de vigilancia endoscópica que utilizan biopsias en cuatro cuadrantes cada cm, solo toman muestras de aproximadamente el 1-2% de la mucosa afectada. Esta limitación de la toma de muestras puede dar lugar a resultados patológicos falsos negativos o una infraestadificación (p. ej., resultados patológicos que muestran solamente MI o DBG en un paciente que tiene DAG o AE) . Por lo tanto, existe una necesidad de mejorar los métodos y las composiciones para distinguir un paciente con DAG y AE de un paciente con DBG + MI + normal y un paciente con DBG de uno normal + MI.

Por ejemplo, Fahmy et al. (Modern Pathology: una revista oficial de la Academia de Patología de los Estados Unidos y Canadá, vol. 17, mayo 2004, páginas 588-596) describe el uso de FISH en muestras citológicas, es decir, biopsia de esófago de Barrett obtenida mediante citología endoscópica convencional por cepillado, utilizando sondas específicas del locus (LSI) para los loci 9p21 (gen p16) y 17p13.1 (gen p53) , junto con su correspondiente CEP para diferenciar el esófago de Barrett con DAG/adenocarcinoma intramucoso de aquellos sin displasia.

Compendio de la invención Es un objeto de la invención proporcionar un método como se define en la reivindicación 1, para la detección en un sujeto de un carcinoma de esófago o una lesión precursora. El método implica el uso de hibridación in situ para detectar anomalías cromosómicas asociadas con un carcinoma de esófago o una lesión precursora. En este método, un conjunto de sondas de ácidos nucleicos marcadas se hibridan con células esofágicas en una muestra para detectar selectivamente en la muestra un carcinoma de esófago y/o una lesión precursora. El patrón de hibridación de las sondas se evalúa entonces y a continuación se correlaciona con la presencia o ausencia de un carcinoma de esófago y/o una lesión precursora.

También se describe en el presente documento un conjunto de sondas de ácido nucleico para uso en el método de la presente invención. El conjunto de sondas se caracteriza por la capacidad de detectar selectivamente un carcinoma de esófago y/o una lesión precursora en la muestra biológica. El conjunto comprende sondas cromosómicas complementarias a regiones diana que son portadoras de anomalías cromosómicas asociadas con una displasia de bajo grado (DBG) o displasia de alto grado (DAG) y adenocarcinoma de esófago (AE) . Se pueden utilizar conjuntos multisonda individuales, no solo para detectar DBG, DAG y AE, sino también para diferenciar DAG

+ AE de DBG + normal + MI y DBG de normal + MI.

Las sondas adecuadas para uso junto con la presente descripción incluyen sondas identificadoras de un locus específico y sondas de recuento de cromosomas. Un conjunto de sondas puede comprender sondas cromosómicas seleccionadas a partir del grupo que consiste en una sonda específica del locus 8q24.12-13, una sonda específica del locus 7p12, una sonda específica del locus 17q11.2-12, una sonda específica del locus 20q13, una sonda de recuento o enumeración del cromosoma 9, una sonda de enumeración del cromosoma 7, una sonda específica del locus 5q21-22, una sonda específica del locus 5p15, una sonda específica del locus 17p13.1, una sonda de enumeración del cromosoma 17 y una sonda específica del locus 9p21. El conjunto de sondas puede comprender, además, una sonda de recuento del cromosoma Y.

Las combinaciones de sondas individuales dentro de un conjunto de sondas han de ser seleccionadas para que tengan una sensibilidad y especificidad combinadas cuando se utilizan en los métodos de la presente invención. Las sondas cromosómicas que detectan las pérdidas o ganancias cromosómicas más frecuentes, asociadas con un carcinoma y/o displasia de esófago, se deben elegir como sondas que se complementan entre sí, basándose en la sensibilidad, especificidad y detectabilidad. En esta invención, los conjuntos de sondas seleccionados para la identificación de DBG tendrán valores DFI que serán como máximo de aproximadamente 0, 7. Los conjuntos de sondas seleccionados para la identificación de DAG + AE tendrán valores DFI que serán como máximo de aproximadamente 0, 5. En cualquier caso, los valores de DFI de menos de 0, 5 proporcionan por lo general incluso mejores resultados, mientras que los valores DFI como máximo de aproximadamente 0, 35 proporcionan por lo general resultados incluso mejores.

La invención se refiere también a una composición según la reivindicación 8, para la detección de carcinoma de esófago o de una lesión precursora.

Breve descripción de las Figuras Las Figuras 1A y 1B muestran los porcentajes promedio de células que muestran una ganancia o pérdida de locus, respectivamente, para cada categoría histológica.

La Figura 2 muestra curvas ROC que ilustran las relaciones entre la sensibilidad y la especificidad para la detección de especímenes de AE más DAG, en relación con el grupo colectivo de especímenes normal, MI y DBG para cuatro posibles combinaciones diferentes de sondas.

La Figura 3 muestra curvas ROC que ilustran las relaciones entre la sensibilidad y la especificidad para la detección de especímenes DBG en relación con especímenes normal + MI para cuatro posibles combinaciones diferentes de sondas.

La Figura 4 muestra curvas ROC que ilustran las relaciones entre la sensibilidad y la especificidad para la detección individual de especímenes AE, DAG, DBG y AE + DAG en relación con especímenes normales, así como para la detección de especímenes AE + DAG en relación con especímenes normal + MI + DBG, así como especímenes DBG en relación con especímenes normales... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de un carcinoma de esófago o una lesión precursora en un sujeto, comprendiendo el método:

a) poner en contacto una muestra biológica que comprende células del esófago procedentes del sujeto con un conjunto de sondas cromosómicas, en donde dicho conjunto consiste en una sonda específica del locus 8q24.12-13, una sonda específica del locus 17q11.2-12, una sonda específica del locus 20q13 y una sonda específica del locus 9p21; y

b) detectar un patrón de hibridación para el conjunto de sondas cromosómicas con la muestra biológica, en donde el patrón de hibridación es indicativo de la presencia o ausencia de un carcinoma de esófago o de una lesión precursora.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la lesión precursora de carcinoma detectada selectivamente es o bien:

a) displasia de bajo grado (DBG) , o b) se selecciona entre el grupo que consiste en displasia de alto grado (DAG) y adenocarcinoma de esófago (AE) .

3. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra biológica comprende células obtenidas a partir de una muestra seleccionada a partir del grupo que consiste en una biopsia, una muestra citológica y una muestra extirpada; y en cuyo caso opcionalmente la muestra biológica comprende un espécimen citológico por cepillado.

4. El método según la reivindicación 1, en el que las sondas cromosómicas están marcadas con fluorescencia.

5. El método según la reivindicación 1, en el que el sujeto ha sido diagnosticado con una afección seleccionada entre el grupo que consiste en enfermedad crónica por reflujo gastroesofágico y esófago de Barrett.

6. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica está incluida en parafina.

7. El método según la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación o bien:

a) se detecta en células que proceden de la muestra biológica que se han seleccionado previamente basándose en anomalías en el tamaño del núcleo, la forma del núcleo o la tinción del núcleo; o b) se evalúa por las ganancias y las pérdidas.

8. Una composición que comprende un conjunto de sondas cromosómicas, en donde el conjunto de sondas cromosómicas es capaz de detectar selectivamente un carcinoma de esófago o una lesión precursora en una muestra biológica y el conjunto de sondas consiste en una sonda específica del locus 20q13, una sonda específica del locus 17q11.2-12, una sonda específica del locus 9p21 y una sonda específica del locus 8q24.12-13.

9. La composición según la reivindicación 8, en donde la lesión precursora de carcinoma es o bien displasia de bajo grado (DBG) o se selecciona entre el grupo que consiste en displasia de alto grado (DAG) y adenocarcinoma de esófago (AE) .