Métodos y kits para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el trasplante de hígado.

La supervivencia a largo plazo de los injertos trasplantados depende de manera crítica de la administración continuada de fármacos inmunosupresores para prevenir el rechazo del injerto. Estos fármacos son muy efectivos para prevenir el rechazo, pero también son responsables de efectos secundarios graves. Los inventores han seleccionado un grupo de genes cuya expresión permite caracterizar el estado de tolerancia en el trasplante hepático en humanos. Basándose en el perfil de expresión de este grupo de genes, los inventores proporcionan un método no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el trasplante hepático en humanos, así como kits para llevarlo a cabo. Estos kits son más sencillos y baratos que otros basados en el análisis de un gran número de genes, tales como los microarrays comerciales que contienen miles de sondas

Métodos y kits para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el trasplante de hígado.

Esta invención se refiere al campo de la medicina humana y específicamente al diagnóstico y/o pronóstico del estado de tolerancia en un trasplante particular.

Estado de la técnica anterior

La supervivencia a largo plazo de los injertos trasplantados depende de manera crítica de la administración continuada de fármacos inmunosupresores para prevenir el rechazo del injerto. Estos fármacos son muy efectivos para prevenir el rechazo, pero también son responsables de efectos secundarios graves, tales como nefrotoxicidad, mayor riesgo de infecciones oportunistas y tumores, y complicaciones metabólicas como diabetes, hiperlipidemia, e hipertensión arterial. A causa de los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores, la inducción de tolerancia, definida como aquel estado en el cual el injerto, mantiene una función normal en ausencia de inmunosupresión crónica, es uno de los objetivos fundamentales de la investigación en inmunología del trasplante. La inducción de tolerancia es posible en un gran número de modelos experimentales de trasplante en roedores. La aplicación de estos tratamientos experimentales en la clínica ha sido sin embargo en gran parte un fracaso. El trasplante hepático es la única situación clínica en la cual la tolerancia se produce de manera espontánea en una proporción substancial de los pacientes. De hecho, la retirada completa del tratamiento inmunosupresor puede alcanzarse en hasta un 21% de los pacientes (cf. J. Lerut et al., "An appraisal of tolerance in liver transplantation", American Journal of Transplantation 2006, vol. 6, pp. 1774-80). Desgraciadamente, carecemos en la actualidad de medios para identificar a estos pacientes tolerantes antes de suprimir el tratamiento inmunosupresor. Por esta razón, la retirada completa de los fármacos inmunosupresores raramente se intenta en el trasplante de hígado, y esto hace que muchos pacientes continúan recibiendo innecesariamente tratamiento inmunosupresor, con los problemas económicos y de salud pública que esto comporta.

Una de las razones por las cuales la aplicación clínica en humanos de los tratamientos experimentales inductores de tolerancia no ha sido exitosa tiene que ver con la falta de una herramienta que permita diagnosticar de manera no invasiva la tolerancia en receptores humanos de trasplante. Publicaciones recientes enfatizan la necesidad imperiosa de contar con esta herramienta (p.ej. N. Najafian et al., "How can we measure immunologic tolerance in humans?", J. Am. Soc. Nephrol. 2006, vol. 17, pp. 2652-63; K. A. Newell et al., "Tolerance assays: measuring the unknown", Transplantation 2006, vol. 81, pp. 1503-9).

Para identificar la tolerancia en el trasplante, fundamentalmente de riñón e hígado, se han utilizado o bien ensayos funcionales antígeno específicos, o bien ensayos antígeno no-específicos. En los ensayos funcionales se prueban linfocitos T del receptor con antígenos del donante, ya sea in vitro o in vivo (cf. J. Cai et al., "Minor H antigen HA-1-specific regulator and effector CD8+ T cells, and HA-1 microchimerism, in allograft tolerance", J. Exp. Med. 2004, vol. 199, pp. 1017-23; E. Jankowska-Gan E et al., "Human liver allograft acceptance and the tolerance assay", Hum. Immunol. 2002, vol. 63, pp. 862-70; M. Hernández-Fuentes et al., "Indices of tolerance: Interim report", abstract #999, World Transplant Congress 2006,). Estos ensayos son muy valiosos desde un punto de vista mecanístico, ya que son los únicos tests capaces de desentrañar los mecanismos responsables de la especificidad del estado de tolerancia. Desgraciadamente, estos ensayos son también difíciles de llevar a cabo, muy variables de laboratorio a laboratorio (difíciles de estandarizar), y requieren la disponibilidad de células del donante que hayan sido criopreservadas de manera cuidadosa. Por estas razones, los tests funcionales no son la metodología óptima para un uso clínico a gran escala, y en la actualidad se realizan únicamente en laboratorios seleccionados, muy especializados, y para fines fundamentalmente de investigación.

Los tests antígeno no-específicos de inmunomonitorización representan un grupo heterogéneo de metodologías encaminadas a caracterizar fenotípicamente el sistema inmune del receptor, sin utilizar para ello antígenos del donante. Entre estos tests, el estudio de los patrones de distribución de la longitud del segmento CDR3 del receptor de células T (TcLand) y el inmunofenotipaje de las células de sangre periférica por citometría de flujo, han sido utilizados para identificar biomarcadores característicos de la tolerancia en humanos. La técnica de TcLand ha sido empleada para discriminar entre receptores de un trasplante renal tolerantes y receptores con rechazo crónico, utilizando muestras de sangre periférica (cf. S. Brouard et al., "Operationally tolerant and minimally immunosuppressed kidney recipients display strongly altered blood T-cell clonal regulation", Am. J. Transplant. 2005, vol. 5, pp. 330-40). Esta técnica, sin embargo, es cara, está disponible en la actualidad en un único laboratorio (Inserm 643 and TcLand Biotech en Nantes, Francia), y no ha sido nunca validada en el trasplante hepático. El inmunofenotipaje de células de sangre periférica mediante citometría de flujo ha sido empleado con muestras de pacientes tolerantes trasplantados de hígado o riñón. Los inventores conocen dos estudios sobre esta metodología. En el primero de ellos, de la Universidad de Pittsburgh en EEUU (cf. G.V. Mazariegos et al., "Dendritic cell subset ratio in peripheral blood correlates with successful withdrawal of immunosuppression in liver transplant patients", Am. J. Transplant. 2003, vol. 3, pp. 689-96), se dice que el cociente entre los subtipos de células dendríticas pDC y mDC podría discriminar entre receptores pediátricos de un trasplante hepático tolerantes y no tolerantes. En el segundo estudio, de Kyoto (cf. Y. Li et al., "Analyses of peripheral blood mononuclear cells in operational tolerance after pediatric living donor liver transplantation", Am. J. Transplant. 2004, vol. 4, pp. 2118-25), se dice que un incremento en el cociente entre las células T gammadelta en sangre periférica, delta-1 y delta-2, es más prevalente en los receptores hepáticos tolerantes que en los no tolerantes. Sin embargo, ninguno de estos tests alcanza la precisión requerida para una aplicación clínica a gran escala.

Aunque el uso crónico de los fármacos inmunosupresores es en la actualidad el único medio de asegurar la supervivencia a largo plazo de los aloinjertos trasplantados, estos fármacos son caros y se asocian a la aparición de efectos secundarios graves (nefrotoxicidad, desarrollo de tumores e infecciones, diabetes, complicaciones cardiovasculares, etc.) que dan lugar a una morbilidad y mortalidad importantes. Por ello, cualquier estrategia capaz de reducir significativamente el uso de los fármacos inmunosupresores en los trasplantes puede tener un impacto notable en la salud y la calidad de vida de los pacientes trasplantados.

Descripción de la invención

Los inventores han seleccionado un grupo de genes cuya expresión caracteriza el estado de tolerancia en el trasplante hepático en humanos. Basándose en el perfil de expresión de este grupo de genes, los inventores proporcionan aquí un método no-invasivo para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el trasplante hepático en humanos.

En este contexto, es pertinente mencionar que el estudio del perfil de expresión genética se ha utilizado previamente para diagnosticar el rechazo tanto en el trasplante de riñón como de corazón, y también para la detección de la tolerancia en el trasplante renal (cf. Miqueu M, et al., "Discrimination of kidney transplant recipients presenting operational tolerance from chronic rejection", abstract #998, World Transplant Congress 2006). En lo que hace referencia al trasplante hepático, se ha publicado un estudio sobre los perfiles de expresión genética de los linfocitos obtenidos de receptores tolerantes en un modelo de trasplante hepático en ratas (cf. Fujino et al., "Differences in lymphocyte gene expression between tolerant and syngeneic liver grafted rats", Liver Transpl. 2004, vol. 10, pp. 379-91). Sin embargo, las tecnologías de expresión genética para detectar tolerancia, sin embargo, no se han utilizado todavía en el trasplante hepático en humanos.

La invención proporciona un método para diagnosticar...

1. Método para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en trasplante hepático en un paciente humano, que comprende los siguientes pasos:

2. Método, según la reivindicación 1, donde los niveles de expresión de los genes se encuentran por encima de un valor umbral pre-determinado obtenido a partir de una muestra control.

3. Método, según la reivindicación 2, donde la muestra control se obtiene de un receptor de trasplante hepático no tolerante que requiere tratamiento inmunosupresor continuado.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la medición de los niveles de expresión de los genes se lleva a cabo utilizando un microarray o un chip genético que comprende sondas de ácidos nucleicos, dichas sondas comprendiendo secuencias que se hibridan de manera específica a los productos de la transcripción del correspondiente grupo de genes.

5. Método, según la reivindicación 4, donde el microarray es un microarray de ADNc.

6. Método, según la reivindicación 4, donde el microarray es un microarray de oligonucleótidos.

7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la medición de los niveles de expresión de los genes se lleva a cabo utilizando transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a partir de ARN extraído de la muestra.

8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la medición de los niveles de expresión de los genes se lleva a cabo midiendo las proteínas codificadas por los correspondientes genes.

9. Método, según la reivindicación 8, donde las proteínas se detectan mediante anticuerpos específicos para las proteínas.

10. Método, según la reivindicación 8, donde las proteínas se detectan mediante un chip de proteínas.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la medición de los niveles de expresión de los genes se lleva a cabo por HPLC.

12. Uso de un kit para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1-11, que comprende (i) medios para medir los niveles de expresión del correspondiente grupo de genes; y (ii) instrucciones para correlacionar los niveles de expresión por encima o por debajo de valores umbral pre-determinados indicativos del estado de tolerancia en el trasplante hepático.

13. Uso del kit, según la reivindicación 12, donde los medios comprenden un microarray o un chip genético que comprende sondas de ácidos nucleicos, dichas sondas comprendiendo secuencias que se hibridan de manera específica a los productos de la transcripción del correspondiente grupo de genes.

14. Uso del kit, según la reivindicación 13, que comprende además reactivos para llevar a cabo el análisis por microarray.

15. Uso del kit, según la reivindicación 12, donde los medios comprenden cebadores oligonucleótidos para llevar a cabo la transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, dichos cebadores comprendiendo secuencias que se hibridan de manera específica al ADN complementario derivado de los productos de la transcripción del correspondiente grupo de genes.

16. Uso de un microarray o un chip genético para llevar a cabo el método definido en las reivindicaciones 2-5, que comprende un soporte sólido sobre el cual se han depositado sondas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias que se hibridan de manera específica a los productos de las transcripción del correspondiente grupo de genes.