Métodos para identificar compuestos de modulación de la linfangiogénesis, medios para ello, compuestos y usos de estos.

Un método para probar si un compuesto es capaz de inhibir el desarrollo de los canales linfáticos o linfangiogénesis y/o la migración de los linfangioblastos en un animal no-humano,

un embrión no-humano o un cultivo de células, que comprende las etapas de:

a. administrar un compuesto capaz de interactuar con un gen Ccbe1, un transcripto de este, o una proteína de ccbe1 a un animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células;

b. determinar si dicho compuesto inhibe el desarrollo de los canales linfáticos, linfangiogénesis y/o migración de los linfangioblastos en dicho animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células.

Métodos para identificar compuestos de modulación de la linfangiogénesis, medios para ello, compuestos y usos de estos Campo de la invención La invención se refiere al campo de la medicina. En particular, la invención se refiere a los campos de linfomagénesis y el cáncer.

Antecedentes de la invención La vasculatura linfática juega roles críticamente importantes en la inflamación, inmunidad, el drenaje de ácidos grasos dietéticos y en la metástasis del cáncer. La evidencia clínica sugiere que la diseminación de los tumores malignos a los nódulos linfáticos regionales a través de los vasos linfáticos es importante en la metástasis de tumor y que la inflamación crónica causa linfangiogénesis y linfedema. Además de VEGF-C, un potente factor de crecimiento linfangiogénico, tienen actividad linfangiogénica VEGF-A, bFGF, HGF, angiopoyetina-1, IGF-1/2, y PDGF-BB, previamente conocidos como factores proangiogénicos. Adicionalmente, se reportaron moléculas lípidicas bioactivas, incluyendo S1P, que inducen linfangiogénesis in vitro e in vivo mediante la estimulación de la migración y diferenciación de células endoteliales linfáticas a través de una ruta de señalización S1P1/Gi/PLC/Ca2+ (Chang Min Yoon y otros Brood. 15 de agosto de 2008; 112 (4) : 11291138) .

Aunque los mecanismos moleculares que regulan la linfangiogénesis no están muy esclarecidos se ha determinado que durante el desarrollo, crecimiento regenerativo o patogénesis, los vasos linfáticos surgen a partir de los vasos pre-existentes por linfangiogénesis, un proceso dinámico que implica la germinación, migración y proliferación de los linfangioblastos, los precursores de la vasculatura linfática.

La manipulación de la linfangiogénesis ofrece la oportunidad de estrategias terapéuticas diseñadas para inhibir o estimular el crecimiento de los vasos linfáticos en afecciones tales como linfedema, cáncer y enfermedades infecciosas.

En la técnica, estas estrategias se han desarrollado sobre la base de factores linfangiogénicos estimulantes tal como usando miembros de la familia VEGF-C (US7150970, US6818220, WO0151075) . Como tal, existe una necesidad de métodos y composiciones para la manipulación de la linfangiogénesis.

Descripción de la invención La invención se relaciona en un primer aspecto con un método para probar si un compuesto es capaz de inhibir el desarrollo de los canales linfáticos o linfangiogénesis y/o la migración de los linfangioblastos en un animal no-humano, un embrión nohumano o un cultivo de células, que comprende las etapas de:

â poner en contacto un compuesto capaz de interactuar con un gen Ccbe1, un transcripto de este o una proteína de ccbe1 con un animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células; y â determinar si dicho compuesto inhibe el desarrollo de los canales linfáticos, linfangiogénesis y/o migración de los linfangioblastos en dicho animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células.

Por el término "compuesto" se entiende cualquier compuesto químico. El compuesto es preferentemente una molécula pequeña, un anticuerpo o fragmento funcional de esta o un agente antisentido.

Por el término "poner en contacto" un compuesto se entiende proporcionar dicho compuesto en una dosis suficientemente alta tal que dicho compuesto puede interactuar con su objetivo molecular, que es el gen Ccbe1, un transcripto de este o una proteína de Ccbe1. Ccbe1 es una proteína secretada, es decir una proteína que se transporta hacia el exterior de la célula. La proteína traducida contiene un péptido señal que se escinde previo a transportarse hacia el exterior de la célula. La proteína secretada probablemente se asocia con el exterior de una célula o matriz extracelular. Por lo tanto, los métodos de poner en contacto pueden diferir entre los objetivos moleculares, pero pueden diferir además en dependencia del tipo de compuesto. Los métodos de proporcionar compuestos a animales y embriones se conocen bien en la técnica. Los compuestos pueden administrarse de cualquier manera efectiva, conveniente que incluye, por ejemplo, la administración por ruta tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar un método adecuado. Preferentemente, la administración de un compuesto a un animal o un embrión se realiza por inyección, debido a que resulta en la mejor captación por las células objetivo.

Un experto en la técnica puede probar cualquier compuesto capaz de interactuar con un gen Ccbe1, un transcripto de este o una proteína de ccbe1. Por el término "interactuar" se entiende cualquier interacción física en donde ocurre la unión covalente o no-covalente entre dicho compuesto y el gen Ccbe1, un transcripto de este o una proteína de ccbe1. El término "Ccbe1" se entiende que se refiere a una proteína que es el dominio 1 de EGF de unión al colágeno y calcio. Ccbe1 se refiere además al ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica la proteína Ccbe1. Las secuencias representativas de ccbe1 pueden encontrarse, por ejemplo, sin limitarse a, en el Banco de Genes con números de acceso NC_005117.2 (Rattus Norvegicus) , NC_000018.8 (Homo Sapiens) , NC_000084.5 (Mus Musculus) , NC_006127.2 (Gallus Gallus) . El gen Ccbe1 se describe además en WO2006/122363 y WO2005/11269. La Figura 4 representa una secuencia de proteína y de nucleótidos de la Ccbe1 humana. Basado en la secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos basada en ella, un experto en la técnica es capaz de diseñar moléculas capaces de interactuar con el gen Ccbe1, un transcripto de este o una proteína de Ccbe1. Por supuesto que puede seleccionarse compuestos que se conocen que interfieren con la proteína de Ccbe1 o la regulación de la expresión de Ccbe1. Al probar estos compuestos con el método de la invención, se obtiene la información valiosa de si estos compuestos son capaces de inhibir la linfangiogénesis. Los anticuerpos dirigidos contra la proteína de Ccbe1 están comercialmente disponibles (Novus Biologicals, anti humano en ratón) . Los métodos para seleccionar anticuerpos con afinidad por una molécula son también conocidos. Por lo tanto, un experto en la técnica puede producir anticuerpos contra la proteína Ccbe1 y probar tales anticuerpos usando este método.

Agentes antisentido pueden usarse además y están comercialmente disponibles (Santa Cruz Biotechnology Inc.) . Métodos para producir los agentes antisentido contra una secuencia objetivo conocida se conocen en la técnica. Un experto en la técnica es capaz de probar si un agente antisentido es capaz de bloquear la expresión de la proteína Ccbe1 al proporcionar dicho agente antisentido a una célula y determinar el nivel de expresión de Ccbe1.

Por el término "animal" se entiende cualquier animal no-humano vivo, que incluyen las larvas de vida libre y/o formas larvales en reproducción, pero que excluyen las formas fetales o embrionarias. Dicho animal puede ser cualquier animal nohumano que tiene un sistema linfático. Preferentemente dicho animal es un vertebrado, debido a que el sistema linfático de los vertebrados evolutivamente está más asociado a los seres humanos que a los sistemas linfáticos de otros animales. Preferentemente, dicho animal es un mamífero, más preferiblemente un roedor o primate. Preferentemente un primate no humano. Por el término "embrión" se entiende un organismo en las etapas primarias de crecimiento y diferenciación. Por el término "cultivo celular" se entiende cualquier cultivo de células in vitro fuera del cuerpo. Cultivos celulares adecuados son el cultivo celular en el que se mimetiza la linfangiogénesis e incluyen los cultivos celulares humanos. Se puede usar cualquier ensayo in vitro que mimetiza la linfangiogénesis. Tales ensayos se conocen en la técnica. Por ejemplo, un ensayo de tubo in-vitro usando células endoteliales linfáticas (LEC) y un ensayo de invasión usando LEC se describen (Nakamura Cancer Sci (95) ; núm.1;p.25-31 (2004) . Dicho animal también puede incluir seres humanos, mientras que el término "animal no humano" se refiere a cualquier animal no humano incluyendo mamíferos y preferentemente un roedor o primate.

En una modalidad preferida, dicho ensayo in-vitro comprende una prueba de migración in vitro. Preferentemente tal prueba de migración in vitro comprende colocar las células (preferentemente LECs) en una cámara (cámara Boy den) que permite a las células moverse a través de una membrana (el fondo de la cámara) en respuesta a un estímulo.

Preferentemente, tal prueba de migración in vitro se basa en una cámara de dos compartimientos llenos de medio separados por una membrana... [Seguir leyendo]

1. Un método para probar si un compuesto es capaz de inhibir el desarrollo de los canales linfáticos o linfangiogénesis y/o la migración de los linfangioblastos en un animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células, que 5 comprende las etapas de:

a. administrar un compuesto capaz de interactuar con un gen Ccbe1, un transcripto de este, o una proteína de ccbe1 a un animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células;

b. determinar si dicho compuesto inhibe el desarrollo de los canales linfáticos, linfangiogénesis y/o migración de los 10 linfangioblastos en dicho animal no-humano, un embrión no-humano o un cultivo de células.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo dirigido contra la proteína Ccbe1 o fragmento funcional de este, y un agente antisentido contra Ccbe1.

3. un método para probar si un compuesto es capaz de inhibir el desarrollo de los canales linfáticos o linfangiogénesis y/o la migración de los linfangioblastos en un animal no-humano, un embrión no-humano, o un cultivo de células, que comprende las etapas de:

a. administrar un compuesto a un animal no-humano, un embrión no-humano, o un cultivo de células, en donde dicho 20 animal no-humano, dicho embrión no-humano, o cultivo celular no expresa la proteína Ccbe1 en un nivel funcional;

b. inducir la expresión de la proteína Ccbe1 en las células de dicho animal no-humano o dicho embrión no-humano; y

c. determinar si dicho compuesto inhibe el desarrollo de los canales linfáticos, linfangiogénesis y/o migración de los linfangioblastos en dicho animal no-humano, dicho embrión no-humano o dicho cultivo celular.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho animal o dicho embrión es transparente.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho animal o dicho embrión se modifica genéticamente, en donde la modificación comprende la expresión transgénica de la estabilina1, tie2, lyve1 y/o fli1 30 fusionada con un GFP o un derivado de este.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dicho animal o dicho embrión se modifica genéticamente tal que se suprime el gen Ccbe1.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho animal o dicho embrión es un pez.

8. Un agente antisentido de Ccbe1 que comprende la secuencia base de:

5'-CGGGTAGATCATTTCAGACACTCTG-3', 4.

5. ACAGCACAGCACTTTACCTGTCTAC-3' .

5. ATTAGCATAGGGAACTTACTTTCG-3' para su uso en un método para tratar el cáncer.

9. Un agente antisentido que tiene entre 15-40 nucleobases de longitud que comprende al menos 8 nucleobases complementarias consecutivas y es capaz de hibridar con una secuencia de nucleótidos que codifica ccbe1, 45 preferentemente de la secuencia base que se representa en la sec. con núm. de ident.:35 para su uso en un método para tratar el cáncer.

10. Un método para determinar si un individuo es un portador de, o padece de, o en riesgo de padecer de, un trastorno de vaso linfático congénito, que comprende proporcionar una muestra de dicho individuo; determinar la presencia de una 50 alteración en la secuencia del gen Ccbe1, y determinar que el individuo es un portador, o padece de, o en riesgo de padecer del trastorno de vaso linfático congénito si dicha alteración está presente.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho trastorno de vaso linfático se selecciona del síndrome Meige, Nonne-Milroy y Hennekam.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde la alteración del gen Ccbe1 resulta en cambios de aminoácidos C75S, C102S, C174R, L229fsX8 y/o G327R.

13. Una composición que comprende la proteína Ccbe1 o un fragmento funcional de esta capaz de inducir la formación del

vaso linfático, o que comprende un ácido nucleico que codifica Ccbe1 o un fragmento funcional de este capaz de

inducir la formación del vaso linfático, para uso como un medicamento para el tratamiento de un trastorno de vaso

linfático.

14. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho trastorno de vaso linfático es un

trastorno de vaso linfático congénito o un trastorno de vaso linfático adquirido seleccionado a partir de linfedema,

cáncer, y un trastorno que resulta de la eliminación o irradiación de los vasos linfáticos.