Métodos de inmunoensayo mejorados.

Un metodo de deteccion de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de unsujeto mamifero,

en el que dicho anticuerpo esta dirigido contra una sustancia extrana introducida en dicho sujetomamifero, comprendiendo el metodo:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antigenoespecifico para dicho anticuerpo,

(b) detectar la cantidad de union especifica entre dicho anticuerpo y dicho antigeno a cada concentracion deantigeno diferente usada, y

(c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha union especifica frente a la cantidad de antigenopara cada cantidad de antigeno usada en la etapa (a), en el que la presencia en la muestra de ensayo deanticuerpo reactivo con el antigeno usado en el ensayo esta indicada por una curva generalmente sigmoidea oen forma de S.

Métodos de inmunoensayo mejorados Campo de la invención La invención se refiere en general al campo de los ensayos de diagnóstico o pronóstico y, en particular, se refiere a la optimización de ensayos para la detección de anticuerpos en una muestra que comprende fluido corporal de paciente, en los que dichos anticuerpos se usan como marcadores biológicos de una susceptibilidad a patología o enfermedad.

Antecedentes de la invención Muchos ensayos de diagnóstico, pronóstico y/o control dependen de la detección de un marcador biológico de una susceptibilidad a patología o enfermedad particular. Dichos marcadores biológicos son comúnmente proteínas o polipéptidos que son característicos de una enfermedad particular o están asociados con la susceptibilidad a enfermedad.

En los últimos años se ha hecho evidente que los anticuerpos, y en particular los autoanticuerpos, también pueden servir como marcadores biológicos de enfermedad o susceptibilidad a enfermedad. Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antígeno que el sistema inmune de un individuo reconoce como extraño aun cuando ese antígeno se originó en realidad en el individuo. Pueden estar presentes en la circulación como autoanticuerpos libres circulantes o en forma de inmunocomplejos circulantes que consisten en autoanticuerpos unidos a su proteína marcadora diana. Las diferencias entre una proteína de tipo silvestre expresada por células “normales” y una forma alterada de la proteína producida por una célula enferma o durante un proceso patológico pueden conducir, en algunos casos, a que la proteína alterada se reconozca por el sistema inmune de un individuo como "no propia" y de este modo genere una respuesta inmune en ese individuo. Ésta puede ser una respuesta inmune humoral (es decir, mediada por células B) que conduzca a la producción de autoanticuerpos inmunológicamente específicos para la proteína alterada.

El documento WO 99/58978 describe métodos para su uso en la detección/diagnóstico del cáncer que están basados en la evaluación de la respuesta inmune de un individuo contra dos o más marcadores tumorales diferentes. Estos métodos implican generalmente poner en contacto una muestra de fluido corporal tomada del individuo con un panel de dos o más antígenos marcadores tumorales diferentes, cada uno derivado de una proteína marcadora tumoral separada, y detectar la formación de complejos de los antígenos marcadores tumorales unidos a autoanticuerpos circulantes inmunológicamente específicos para las proteínas marcadoras tumorales. La presencia de dichos autoanticuerpos circulantes se toma como un indicio de la presencia de cáncer.

Rasmussen et al., (Journal of immunological methods, vol. 127, nº 1 páginas 139 a 145, 1990) describe un ELISA dirigido contra una única concentración de un antígeno autólogo. Más específicamente, se refiere a un ELISA para la detección de anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos.

Los ensayos que miden la respuesta inmune del individuo respecto a la presencia de proteína marcadora tumoral en términos de la producción de autoanticuerpos proporcionan una alternativa a la medición o detección directa de proteína marcadora tumoral en fluidos corporales. Dichos ensayos constituyen esencialmente una detección indirecta de la presencia de proteína marcadora tumoral. Debido a la naturaleza de la respuesta inmune, es probable que puedan generarse autoanticuerpos por una cantidad muy pequeña de proteína marcadora tumoral circulante y, por consiguiente, los métodos indirectos que dependen de la detección de la respuesta inmune contra marcadores tumorales serán más sensibles que los métodos para la medición directa de marcadores tumorales en fluidos corporales. Por lo tanto, los métodos de ensayo basados en la detección de autoanticuerpos pueden ser de un valor particular pronto en el proceso patológico, y posiblemente también en relación con la exploración de pacientes asintomáticos, por ejemplo en la exploración para identificar individuos "en riesgo" de desarrollar una enfermedad entre una población de individuos asintomáticos, para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad entre una población de individuos asintomáticos. Además, el método basado en la detección de autoanticuerpos puede ser de un valor particular pronto en el proceso patológico, y posiblemente también puede usarse para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad entre una población de individuos sintomáticos. Además, pueden ser útiles para la detección temprana de una enfermedad recurrente. Los métodos de ensayo también pueden ser de valor en terapias de selección o control para una enfermedad.

Los anticuerpos y autoanticuerpos también pueden servir como marcadores biológicos de otras patologías o susceptibilidades a enfermedad, de las cuales no son sino ejemplos la artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , cirrosis biliar primaria (PBC) , tiroiditis autoinmune (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto) , gastritis autoinmune (por ejemplo, anemia perniciosa) , adrenalitis autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Addison) , hipoparatiroidismo autoinmune, diabetes autoinmune (por ejemplo, diabetes Tipo 1) , miastenia grave.

Los presentes inventores han reconocido que cuando se usan de modo diagnóstico o pronóstico ensayos basados en la detección de anticuerpos para evaluar la patología, la progresión de la enfermedad o la susceptibilidad a enfermedad de un individuo dentro de una población, pueden surgir dificultades para concebir una metodología de ensayo normalizada apropiada para toda la población de sujetos a explorar, ya que las cantidades absolutas de anticuerpo presente varían radicalmente de un individuo a otro. Esto puede producir una alta incidencia de resultados falsos negativos, por ejemplo entre individuos que tengan una baja cantidad de anticuerpo. De forma similar, existe la dificultad de puntuar resultados positivos verdaderos, ya que la variación en las cantidades absolutas de anticuerpo de un individuo a otro significa que es difícil establecer un umbral para un resultado de ensayo positivo que sea apropiado para todos los individuos dentro de la población explorada.

Los presentes inventores han determinado ahora que el rendimiento y, más específicamente, la utilidad y fiabilidad clínica de ensayos basados en la detección de anticuerpos, particularmente autoanticuerpos, como marcadores biológicos de enfermedad pueden mejorarse espectacularmente por inclusión de una etapa de titulación de antígeno. Por ensayo de la muestra sospechosa de contener anticuerpos contra una serie de cantidades diferentes de antígeno y construcción de una curva de titulación es posible identificar de forma fiable resultados de exploración positivos verdaderos, independientemente de la cantidad absoluta de anticuerpo presente en la muestra. Una estrategia de este tipo es contraria a métodos de la técnica anterior que titulan antígeno simplemente para construir una curva de calibración para permitir la identificación de la concentración de antígeno más apropiada para usar para detectar anticuerpos en muestras de pacientes reales. En estos métodos sólo se propone una medición de un único punto para el diagnóstico real. Por lo tanto, estos métodos no permitirán variaciones en las cantidades del anticuerpo a detectar de un individuo a otro, dando como resultado la incidencia de falsos positivos y falsos negativos que se analiza. Los presentes inventores han descubierto que el método de titulación de antígeno de la invención analizado en la presente memoria tiene mayor especificidad y sensibilidad que medir la reactividad de autoanticuerpos a una única concentración de antígeno, o métodos en los que se titula la muestra de suero más que el antígeno.

Sumario de la invención La invención proporciona un método de detección de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo está dirigido contra una sustancia extraña introducida en dicho sujeto mamífero, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(b) detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno a cada concentración de antígeno diferente usada, y

(c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usada en la etapa (a) , en el que la presencia... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo está dirigido contra una sustancia extraña introducida en dicho sujeto 5 mamífero, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo, (b) detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno a cada concentración de 10 antígeno diferente usada, y (c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usada en la etapa (a) , en el que la presencia en la muestra de ensayo de anticuerpo reactivo con el antígeno usado en el ensayo está indicada por una curva generalmente sigmoidea o en forma de S.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la detección de la presencia de dicho anticuerpo está basada en los valores colectivos de la cantidad de unión específica para todas las concentraciones de antígeno ensayadas.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el sujeto mamífero es un ser humano. 20

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia extraña es un agente terapéutico.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente terapéutico es un fármaco, profármaco o 25 terapia de anticuerpos.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia extraña es una vacuna.

30 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que la sustancia extraña es una porción no diana de un agente terapéutico o vacuna.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la porción no diana es biotina.

35 9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sustancia extraña es un agente infeccioso tal como un hongo, bacteria, virus o parásito.