Método para producir un vector de administración dirigida que comprende partículas retrovirales para inhibir la metástasis tumoral,

comprendiendo dicho método las siguientes etapas: A) transfección transitoria de una célula productora con: i) un primer plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína anfotrópica de envoltura 4070A modificada para contener un dominio de enlace de colágeno, en el que la secuencia de ácido nucleico está enlazada operativamente a un promotor, y en el que el dominio de enlace de colágeno comprende la secuencia de aminoácido Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Leu-Ser-Ala-Ala obtenida a partir del dominio D2 del factor de von Willebrand; ii) un segundo plásmido, que comprende: (a) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido retroviral gag-pol, (b) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a medicamentos a la célula productora, (c) un origen de SV40 de replicación; iii) un tercer plásmido, que comprende: (a) una secuencia heteróloga de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido de diagnóstico o terapéutico, (b) secuencias de repetición terminal larga 5'y 3'(LTRs), (c) una secuencia de empaquetado retroviral Ψ (d) un promotor CMV antepuesto a la LTR 5' (e) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a medicamentos a la célula productora, (f) un origen de SV40 de replicación, en el que la célula productora es una célula humana que expresa un antígeno grande T de SV40; B) cultivar las células productoras según A) en condiciones que permitan la producción de vectores de administración dirigida y su liberación en los sobrenadantes del cultivo; (C) aislar e introducir los sobrenadantes en un sistema de colector de bucle cerrado que comprende una bolsa tipo flexboy® y un sistema de colector, en el que la bolsa tipo flexboy está formada por una película coextrusionada de tres capas que consta de una capa de contacto con el fluido fabricada con etil vinil acetato, una barrera al gas de Etilen vinil alcohol y una capa exterior de etil vinil acetato para la recolección de las partículas virales; (D) recogida y concentración de los vectores de administración dirigidos, y (E) tratamiento de dichos vectores de administración dirigidos con un agente de degradación del ADN que no provoque una pérdida de la potencia del vector.

Campo Técnico

La presente invención se refiere en términos generales a unos métodos de fabricación de vectores terapéuticamente efectivos.

Antecedentes

Aproximadamente un 7% de todos los protocolos de terapia genética están enfocados al tratamiento del cáncer metastático. La mayor parte de los protocolos activos se refieren a algún tipo de inmunoterapia contra el cáncer mediante transferencia genética basada en células de citoquinas de antígenos tumorales, mientras otros conllevan el aporte intratumoral de virus oncolíticos o vectores de transporte de promedicamentos, agentes quimioprotectores, constructos antisentido, o genes supresores de tumores. No obstante, el principal problema que queda por resolver y que ha obstaculizado el desarrollo y el despliegue de una terapia genética anticáncer efectiva es la del ineficiente aporte in vivo a las células de destino, un problema que obstaculiza e impide multitud de enfoques terapéuticos directos (Tseng y Mulligan, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 11:537-569, 2002). A este respecto, la aparición de las dianas patotrópicas ha supuesto un nuevo paradigma en la terapia genética anticáncer. Al abordar la histopatología de la lesión - en lugar de las células cancerosas per se - para optimizar la concentración efectiva del vector en los puntos metastáticos, aumentó enormemente la seguridad y la eficacia del vector de la terapia genética de circulación en los estudios preclínicos (Gordon y otros, Cancer Res. 60:3343-3347, 2000; Gordon y otros, Hum. Gene Ther. 12:193-204, 2001). Los resultados preclínicos y clínicos del vector patotrópico, que se ven mejorados aún más por las propiedades inherentes del vector vírico de la leucemia murina (cuya selectividad transluce la división celular) y la especificidad estratégica de un gen de control del ciclo celular que presenta actividad tumoricida y antiángiogénica (Gordon y otros, Hum. Gene Ther. 12:193-204, 2001), crea la posibilidad del aporte sistémico de medicamentos genéticos para el control fisiológico y el tratamiento de los cánceres primarios, remotos, metastáticos y ocultos.

En Lenz y otros, Human Gene Therapy 13: 1515-1537 (10 de agosto de 2002) se proporciona un protocolo clínico para la evaluación específica del emplazamiento tumoral de Fase I de la seguridad y la eficacia de la infusión arterial hepática de un vector retroviral dirigido a la matriz y que porte un constructo de ciclina dominante negativo G1 como intervención para el tratamiento de la metástasis hepática del carcinoma colorectal.

Resulta deseable disponer de vectores mejorados, de sistemas de producción de los vectores mejorados y de regímenes de tratamiento para la administración de dichos vectores, de forma que puedan utilizarse los sistemas de administración dirigidos dentro de un entorno clínico.

Sumario

La presente invención se refiere a un método para la elaboración de partículas de vector retrovirales “dirigidas”.

En relación con el método de la presente invención, se presentan nuevos sistemas de expresión retroviral, para la generación de las partículas víricas dirigidas, la utilización de las células productoras humanas transfectadas transitoriamente para la producción de las partículas, un proceso de fabricación para la producción a gran escala de las partículas virales y métodos para la recogida y el almacenamiento de vectores virales dirigidos.

En una realización se proporciona un método para producir un vector de administración dirigido. El método incluye las siguientes etapas:

A) transfección transitoria de una célula productora con:

i) un primer plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína anfotrópica de envoltura 4070A modificada para contener un dominio de enlace de colágeno, en el que la secuencia de ácido nucleico está enlazada operativamente a un promotor, y en el que el dominio de enlace de colágeno comprende la secuencia de aminoácido Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Leu-Ser-Ala-Ala obtenida a partir del dominio D2 del factor de von Willebrand;

ii) un segundo plásmido, que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido retroviral gag-pol,

(b) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido que confiere a la célula productora resistencia a medicamentos,

(c) un origen de SV40 de replicación,

iii) un tercer plásmido, que comprende:

(a) una secuencia heteróloga de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido de diagnóstico o terapéutico,

(b) secuencias de repetición terminal larga 5' y 3' (LTRs),

(c) una secuencia de empaquetado retroviral ψ,

(d) un promotor CMV antepuesto a la LTR 5',

(e) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido que confiere a la célula productora resistencia a medicamentos,

(f) un origen de SV40 de replicación, en el que la célula productora es una célula humana que expresa un antígeno grande T de SV40;

B) cultivar las células productoras de A) en unas condiciones que permitan la producción de vectores de administración dirigida y su liberación en los sobrenadantes del cultivo;

C) Aislar e introducir los sobrenadantes en un sistema de colector de bucle cerrado que comprende una bolsa tipo Flexboy® y un sistema de colector, en el que la bolsa tipo flexboy está formada por una película coextrusionada de tres capas que consta de una capa de contacto con el fluido fabricada con etil vinil acetato, una barrera al gas de etilen vinil alcohol y una capa exterior de etil vinil acetato para la recolección de las partículas virales;

(D) recoger y concentar los vectores de administración dirigidos, y

(E) tratamiento de dichos vectores de administración dirigidos con un agente de degradación del ADN que no provoque una pérdida de la potencia del vector.

En uno de los aspectos, la célula productora es una célula 293T.

Como se ha mencionado anteriormente, el método también incluye el cultivar las células productoras transfectadas en unas condiciones que permitan la producción del vector de administración dirigida en los sobrenadantes del cultivo y el aislamiento y la introducción del sobrenadante en un sistema de colector de bucle cerrado para la recolección del vector. En las figuras 19A y 19B se presenta un ejemplo de sistema colector de bucle cerrado. El vector de administración dirigida es una partícula retroviral.

En un aspecto, el primer plásmido es el plásmido Bvl/pCAEP el segundo plásmido es el plásmido pCgpn, y el tercer plásmido es el plásmido pdnGl/C-REX o el plásmido pdnGl/C-REX II.

Las partículas recolectadas suelen presentar una titulación viral de entre 1 x 107 y 1 x 1010 unidades de formación de colonias por mililitro. Por otra parte, las partículas víricas suelen tener un diámetro de entre 50 nm y 150 nm.

El dominio de enlace del colágeno incluye un péptido obtenido a partir del dominio D2 del factor de von Willebrand. Por lo general, el factor de von Willebrand se obtiene a partir de un mamífero. El péptido incluye la secuencia de aminoácido Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Leu-Ser-Ala-Ala. En una realización preferida, el péptido está contenido en la porción gp70 de la proteína proteína anfotrópica de envoltura 4070A.

En una realización, el polipéptido de uso terapéutico es un mutante de supresión del terminal N de la ciclina G1, la interleucina-2 (IL-2), y el factor estimulante de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF) o la timidina quinasa.

Los vectores de administración dirigida descritos en el presente documento suelen contener secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de diagnóstico o terapéuticos. Como se describe en mayor detalle en otros pasajes de esta especificación, los ejemplos de proteínas terapéuticas y polipéptidos no se limitan a las clases de proteínas suicidas, proteínas inductoras de la apoptosis, citoquinas, interleucinas y proteínas de la familia TNF. Los ejemplos de proteínas de diagnóstico o péptidos incluyen, por ejemplo, la proteína verde fluorescente y la luciferasa.

El vector de administración dirigida así obtenido resulta útil para un método de tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un vector de administración dirigida que comprende partículas retrovirales para inhibir la metástasis tumoral, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

A) transfección transitoria de una célula productora con:

i) un primer plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína anfotrópica de envoltura 4070A modificada para contener un dominio de enlace de colágeno, en el que la secuencia de ácido nucleico está enlazada operativamente a un promotor, y en el que el dominio de enlace de colágeno comprende la secuencia de aminoácido Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Leu-Ser-Ala-Ala obtenida a partir del dominio D2 del factor de von Willebrand;

ii) un segundo plásmido, que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido retroviral gag-pol,

(b) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a medicamentos a la célula productora,

(c) un origen de SV40 de replicación; iii) un tercer plásmido, que comprende:

(a) una secuencia heteróloga de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido de diagnóstico o terapéutico,

(b) secuencias de repetición terminal larga 5' y 3' (LTRs),

(c) una secuencia de empaquetado retroviral ψ,

(d) un promotor CMV antepuesto a la LTR 5',

(e) una secuencia de ácido nucleico enlazada operativamente a un promotor, y en el que la secuencia codifica un polipéptido que confiere resistencia a medicamentos a la célula productora,

(f) un origen de SV40 de replicación, en el que la célula productora es una célula humana que expresa un antígeno grande T de SV40;

B) cultivar las células productoras según A) en condiciones que permitan la producción de vectores de administración dirigida y su liberación en los sobrenadantes del cultivo;

(C) aislar e introducir los sobrenadantes en un sistema de colector de bucle cerrado que comprende una bolsa tipo flexboy® y un sistema de colector, en el que la bolsa tipo flexboy está formada por una película coextrusionada de tres capas que consta de una capa de contacto con el fluido fabricada con etil vinil acetato, una barrera al gas de Etilen vinil alcohol y una capa exterior de etil vinil acetato para la recolección de las partículas virales;

(D) recogida y concentración de los vectores de administración dirigidos, y

(E) tratamiento de dichos vectores de administración dirigidos con un agente de degradación del ADN que no provoque una pérdida de la potencia del vector.

2. Método de la reivindicación 1, en el que el dominio de enlace del colágeno está contenido en la porción gp70 de la proteína envolvente anfotrópica 4070A.

3. Método de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipétido terapéutico es un mutante de supresión del extremo N de la ciclina GI.

4. Método de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipétido terapéutico es interleucina-2 (IL-2).

5. Método de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipétido terapéutico es el factor estimulante de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF).

6. Método de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipétido terapéutico es la timidina quinasa.

7. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el primer plásmido es el plásmido Bvl/pCAEP mostrado en la Figura 12A.

8. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el segundo plásmido es el plásmido pCgpn mostrado en la Figura 13A.

9. Método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tercer plásmido se obtiene a partir del plásmido GIXSvNa mostrado en la Figura 10A.