Un método para liberar una proteína de interés de células hospedadoras que comprende poner en contacto las células hospedadoras con un agente reductor y un detergente,

en el que el detergente se selecciona entre el grupo que consiste en: dimetildecilamina, dimetilundecilamina, dimetildidecilamina, dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina, óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de dimetiltridecilamina

Métodos y composiciones para extraer proteínas de células.

1. Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para recuperar proteínas intracelulares y otras moléculas de una célula.

2. Antecedentes de la invención

Es deseable lisar células cultivadas como hospedadores de producción que contienen una proteína u otra molécula de interés para recuperar cualquier producto deseado producido intracelularmente. Los modos convencionales de destruir y lisar tales células incluyen el uso de calor (Patente de Estados Unidos Nº 4.601.986 de Wegner, et al.), presión osmótica (Patente de Estados Unidos Nº 4.299.858 de Aubert, et al), enzimas que descomponen las paredes o las membranas celulares (Patente de Estados Unidos Nº 3.816.260 de Sugiyama, Patente de Estados Unidos Nº 3.890.198 de Kobayashi, et al. y la Patente de Estados Unidos Nº 3.917.510 de Kitamura, et al.) y alteración mecánica de la pared celular, por ejemplo, por homogeneización a alta presión.

También se han utilizado detergentes para lisar la pared celular. Por ejemplo, el reactivo de extracción de proteína de levadura (Y-PER®), comercializado por Pierce Chemical Company, contiene un detergente para proporcionar un medio suave de lisis celular que no es perjudicial para la proteína de interés. Sin embargo, Y-PER® tiene por objeto el uso como un reactivo experimental de laboratorio, no como un reactivo útil para la producción a gran escala de proteínas, y es costoso. Por estos motivos, Y-PER® no ha obtenido aceptación como un reactivo útil para la producción a gran escala de proteína recombinante de células hospedadoras.

Existe una necesidad en la técnica de un proceso que se pueda usar para provocar de forma sencilla la liberación de proteínas de células hospedadoras sin dañar la proteína deseada y con un mínimo de etapas de proceso. El método de lisis celular no debe conducir directa o indirectamente a la desnaturalización del producto deseado y el método debe ser coherente con los requisitos de procesamiento posteriores y con la producción a gran escala.

3. Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para liberar una proteína, recombinante u otra, de una célula. El proceso de la presente invención implica poner las células hospedadoras en contacto con un agente reductor y un detergente, donde el detergente se selecciona entre el grupo que consiste en: dimetildecilamina, dimetilundecilamina, dimetildidecilamina, dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina, óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de dimetiltridecilamina.

La adición de uno o más agentes reductores facilita la recuperación de proteínas en sus conformaciones nativas. Los métodos de la invención son particularmente adecuados para producción a gran escala de productos recombinantes. Los métodos de la invención comprenden cuatro etapas básicas: ajuste de condiciones de solución voluminosa para conseguir un entorno permisivo, contacto de células con un agente reductor antes, durante o después del contacto de las células con ciertos detergentes como se ha mencionado anteriormente y, finalmente, aclaramiento del extracto para producir una fracción adecuada para la formulación o procesamiento adicional. Típicamente, el agente reductor y el detergente se añaden secuencialmente en cualquier orden, dando como resultado la exposición concurrente de las células al agente reductor y al detergente.

Los detergentes se pueden usar a concentraciones que varían del 0,01% hasta su límite de solubilidad. Preferiblemente, las concentraciones de los detergentes varían del 0,05% al 5%, del 0,1% al 2% o son aproximadamente el 0,5% de la solución total. Cuando se añade a células suspendidas en tampón, el detergente está preferiblemente a una mayor concentración que la concentración final a la que se lisan las células. Preferiblemente, el detergente está a una concentración al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces o 100 veces superior.

En una realización particular, el uno o más agentes reductores son los agentes reductores que reducen los enlaces disulfuro y/o mantienen los restos sulfhidrilo en la forma reducida. Cualquiera de tales agente o agentes reductores se pueden usar. En una realización preferida, el uno o más agentes reductores usados se seleccionan entre el grupo que consiste en Ditiotreitol (DTT); Ditioeritritol (DTE), Cisteína (Cys) y Tris[2-carboxietil]fosfina (TCEP).

Los agentes reductores se pueden usar a concentraciones que varían de 0,1 mM a 100 mM, de 1 mM a 25 mM, de 2 mM a 10 mM o aproximadamente 5 mM. Cuando se añaden a células suspendidas en tampón, el agente reductor está preferiblemente a una mayor concentración que la concentración final a la que se lisan las células. Preferiblemente, el detergente está a una concentración al menos 2 veces, 5 veces, veces o 100 veces superior.

Además del uno o más detergentes y agentes reductores, en una realización preferida, las células también se ponen en contacto con glicerol. Preferiblemente, la concentración de glicerol es al menos el 0,6% o varía del 0,6% al 20%, del 0,6% al 15%, del 0,6% al 12%, del 0,6% al 6%, del 0,6% al 3% o del 0,6% al 1%.

El pH de la solución puede variar de pH 2 a pH 12. Preferiblemente, la solución está a un pH que varía de pH 5,0 a pH 8,0. Más preferiblemente, el pH varía de pH 5,5 a pH 7,4, de pH 6 a 7,4, de pH 7,0 a 7,4 o es aproximadamente pH 7,3.

La recuperación de proteína de las células con la solución de la invención se puede realizar a una temperatura de 2ºC a 50ºC. Preferiblemente, la temperatura es de 2ºC a 30ºC, de 2ºC a 20ºC, de 2ºC a 10ºC, de 3ºC a 10ºC, aproximadamente 4ºC, aproximadamente 25ºC o es temperatura ambiente.

Las "células hospedadoras" son células que contienen una proteína de interés. Una "proteína de interés" es cualquier proteína presente en una célula hospedadora que se desea liberar de la célula hospedadora y, opcionalmente, aislar o purificar posteriormente. Preferiblemente, la proteína de interés es una proteína recombinante. En una realización preferida, la proteína de interés tiene un peso molecular de menos de 100 kD. En una realización preferida adicional, la proteína de interés tiene un peso molecular entre 5 y 75 kD, preferiblemente aproximadamente 50 kD. Las células hospedadoras pueden ser de cualquier tipo, preferiblemente de mamífero, bacterianas, de levadura, fúngicas, vegetales, aviares o de reptiles. Más preferiblemente, las células hospedadoras son células de levadura. En una realización particular, las células de levadura son de la especie Pichia pastoris.

Además de liberar proteínas de células hospedadoras, el proceso de la invención se puede usar para liberar otras moléculas de células hospedadoras que incluyen ácidos nucleicos, lípidos, vitaminas, moléculas pequeñas y otras moléculas o complejos moleculares obtenidos de células, citosólicos o de orgánulos.

Alternativamente, la presente invención se refiere a un método para liberar una proteína de interés de células hospedadoras que comprenden poner en contacto las células hospedadoras con un detergente, donde el detergente es dimetiltetradecilamina y que comprende además la etapa de añadir glicerol a las células hospedadoras.

4. Breve descripción del dibujos

Las diversas características de la invención pueden comprenderse más completamente a partir de la siguiente descripción cuando se lee junto con el dibujo adjunto.

Figura 1

Extracción de rBoNTA(Hc) con y sin DTT a 4ºC y 21ºC

La Figura 1 muestra el efecto del tiempo, temperatura y el agente reductor sobre la recuperación de una proteína de interés de una célula hospedadora.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para liberar una proteína, recombinante u otra, de una célula. Los métodos de la invención comprenden cuatro etapas básicas: ajuste de condiciones de solución voluminosa para conseguir un entorno permisivo, contacto de las células con un agente reductor antes, durante o después del contacto de las células con ciertos detergentes y, finalmente, aclaramiento del extracto para producir una fracción adecuada para formulación o procesamiento adicional.

En una realización particular, las condiciones de solución se ajustan por 1) sedimentación...

1. Un método para liberar una proteína de interés de células hospedadoras que comprende poner en contacto las células hospedadoras con un agente reductor y un detergente, en el que el detergente se selecciona entre el grupo que consiste en: dimetildecilamina, dimetilundecilamina, dimetildidecilamina, dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina, óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de dimetiltridecilamina.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de añadir glicerol a las células hospedadoras suspendidas.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el detergente comprende una concentración final entre el 0,01 por ciento y el 10 por ciento.

4. El método de la reivindicación 2, en el que el glicerol comprende una concentración final entre el 0,6 y el 15 por ciento.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el glicerol comprende una concentración final entre el 0,6 y el al 6 por ciento.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el agente reductor se selecciona entre el grupo que consiste en Ditiotreitol (DDT); Ditioeritritol (DTE); Cisteína (Cys) y Tris[2 carboxietil]fosfina (TCEP).

7. El método de la reivindicación 6, en el que el agente reductor está a una concentración de 0,1 mM a 100 mM.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de incubar la célula y la mezcla de detergente y agente reductor de 90 minutos a 24 horas.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la incubación es de 8 horas a 24 horas.

10. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de incubar la célula y la mezcla de detergente y agente reductor a una temperatura entre 3ºC y 10ºC.

11. El método de la reivindicación 1, en el que las células hospedadoras son células de Pichia pastoris.

12. Un método para liberar una proteína de interés de células hospedadoras que comprende poner en contacto las células hospedadoras con un detergente, en el que el detergente es dimetiltetradecilamina y que comprende además la etapa de añadir glicerol a las células hospedadoras.