Método de tratamiento de cáncer que comprende un antagonista de VEGF-B.

Anticuerpo anti-VEGF-B aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe la unión de VEGF-B a VEGFR-1,

en el que el anticuerpo se une a VEGF-B humano con un valor de KD de 1 x 10-7 M o menos, en el que el anticuerpo reacciona de manera cruzada con VEGF-B humano y VEGF-B murino, y en el 5 que el anticuerpo comprende una cadena ligera con CDR que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 5 a 7, y una cadena pesada con CDR que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 8 a 10.

Método de tratamiento de cáncer que comprende un antagonista de VEGF-B

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere en general al campo de la profilaxis y la terapia contra el cáncer. Más particularmente, la presente invención proporciona antagonistas de factores de crecimiento que inhiben el crecimiento de cánceres incluyendo tumores y tejido precanceroso. Incluso más particularmente, la presente invención se refiere a antagonistas de factor de crecimiento endotelial vascular-B y a su uso para inhibir el crecimiento de cáncer incluyendo tejido tumoral y tejido precanceroso.

Descripción de la técnica anterior

Se recogen también al final de la descripción detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia en esta memoria descriptiva.

La referencia a cualquier técnica anterior no es, y no debe tomarse como un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

El desarrollo de vasos sanguíneos y de suministro vascular es un requisito fundamental para el desarrollo y la diferenciación de órganos durante la embriogénesis, así como para procesos fisiológicos posnatales normales tales como cicatrización de heridas, regeneración de tejidos y órganos y crecimiento cíclico del cuerpo lúteo y el endometrio (Folkman & Klagsbrun, Science, 235 (4787) : 442-447, 1987; Klagsbrun & D’Amore., Ann. Rev. Physiol. 53:217-239, 1991; Carmeliet et al., Nature 380:435-439, 1996; Ferrara et al., Nature 380:439-442, 1996) . El crecimiento y la maduración de nuevos vasos (angiogénesis) es un proceso altamente complejo y coordinado y requiere la activación secuencial de una serie de receptores mediante numerosos ligandos (Yancopoulos et al., Nature 407:242-248, 2000; Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364, 1999; Carmeliet, Nature 407:249-257, 2000) . Podría decirse que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF o VEGF-A) es el más meticulosamente caracterizado de estos ligandos y la señalización por VEGF-A parece representar una etapa limitante de la velocidad crítica en el proceso (Ferrara et al., Nature Medicine 9:669-676, 2003) .

Además de procesos fisiológicos normales, se sabe también que el crecimiento patológico de tumores depende del grado de formación de nuevos vasos sanguíneos en el lecho tumoral (Carmeliet et al., 2000 citado anteriormente; Folkman, Nature Medicine 1:27-31, 1995; Hanahan & Folkman, Cell 86:353-364, 1996) . El ARNm de VEGF-A está regulado por incremento en muchos tumores humanos y VEGF-A parece ser un factor angiogénico importante utilizado frecuentemente por tumores para activar el crecimiento de vasos sanguíneos (Dvorak et al., Semin Perinatol 24:75-78, 2000; Ferrara & Alitalo, 1999 citado anteriormente; Yancopoulos, 2000 citado anteriormente; Benjamin & Keshet, Proc Natl Acad Sci USA 94:8761-8766, 1997; Ferrara y Davis-Smyth, Endocr. Rev 18:4-25, 1997) . VEGFA también aumenta la permeabilidad vascular, y se cree que esto es importante para la invasión y metástasis tumorales (Dvorak et al., Curr Top Microbiol Immunol 237:97-132, 1999) . Como resultado, ha habido un esfuerzo significativo hacia el desarrollo de agentes que seleccionen como diana factores angiogénicos tales como 45 VEGF-A con el fin de inhibir el crecimiento tumoral (Ferrara et al., 2003 citado anteriormente) . Uno de tales agentes es bevacizumab, un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado que se une a, e inhibe la actividad de, VEGF-A. Bevacizumab (Avastin) se ha aprobado recientemente por la FDA para el tratamiento de cáncer colorrectal.

VEGF-A se reconoce ahora como el miembro fundador de una familia de moléculas relacionadas estructuralmente. La “familia de VEGF” comprende seis miembros incluyendo VEGF-A prototípica, factor de crecimiento de la placenta (PLGF) , VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E (Eriksson & Alitalo, Curr Top Microbiol Immunol 237:41-57, 1999) . Las funciones biológicas de la familia de VEGF están mediadas por la activación diferencial de al menos tres receptores tirosina cinasa estructuralmente homólogos, VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2/Flk-1/KDR y VEGFR-3/Flt-4. VEGF-A, VEGF-B y PLGF se unen también a los receptores no tirosina cinasa neuropilina-1 y -2, Soker et al., Cell

92:735-45, 1998; Neufeld et al., Trends Cardiovasc Med. 12: 13-19, 2002) . Según sus patrones de unión al receptor, la familia de VEGF puede dividirse en tres subgrupos: (1) VEGF-A, que se une a VEGFR-1 y VEGFR-2; (2) PLGF y VEGF-B, que se unen sólo a VEGFR-1 y; (3) VEGF-C y VEGF-D, que interaccionan con tanto VEGFR-2 como VEGFR-3 (Ferrara & Alitalo, 1999 citado anteriormente; Ferrara et al., 2003 citado anteriormente) .

Tal como se indicó anteriormente, VEGF-A es el miembro más meticulosamente caracterizado de la familia de VEGF y una acumulación de pruebas ha conducido a la conclusión de que VEGFR-2 es el principal mediador de las actividades biológicas asociadas a VEGF-A tales como proliferación, migración y supervivencia de células endoteliales, angiogénesis y permeabilidad vascular (Ferrara et al., 2003 citado anteriormente) . Además de VEGFR2, VEGF-C y -D también se unen a, y activan, VEGFR-3. VEGFR-3 se expresa principalmente en células 65 endoteliales linfáticas y se cree que VEGF-C y -D son reguladores clave de la angiogénesis linfática [o linfangiogénesis] (Makinen et al., Nature Medicine 7:199-205, 2001; Skobe et al., Nature Medicine 7:192-8, 2001;

Stacker et al., Nature Medicine 7:186-91, 2001) . En contraposición a VEGF-A, -C y -D y los efectos posteriores de la señalización a través de VEGFR-2 o -3, el papel preciso de VEGF-B y la señalización a través de VEGFR-1 siguen entendiéndose mal.

VEGFR-1 se expresa en una variedad de tipos de células (Clauss et al., J. Biol. Chem. 271:17629-17634, 1996; Wang & Keiser, Circ. Res. 83:832-840, 1998; Niida et al., J. Exp. Med. 190:293-298, 1999) y su expresión, al menos en células endoteliales, se regula por incremento por hipoxia y un mecanismo dependiente de HIF-1D (Gerber et al.,

J. Biol. Chem. 272:23659-23667, 1997) . Sin embargo, sólo se observa autofosforilación débil de VEGFR-1 en respuesta a VEGF-A, y la unión de VEGF-A a VEGFR-1 parece no activar las señales posteriores requeridas para respuestas de células endoteliales clave tales como proliferación y supervivencia (de Vries et al., Science 255:989991, 1992; Waltenberger et al., J. Biol. Chem. 269:26988-26995, 1994; Keyt et al., J. Biol. Chem. 271:5638-5646, 1996; Rahimi et al., J. Biol. Chem. 275:16986-16992, 2000) . La observación de que el ligando específico de VEGFR1, PLGF, potenciaba la actividad de VEGF-A sobre células endoteliales sugirió que VEGFR-1 podría funcionar como un receptor señuelo, es decir, PLGF desplazaba VEGF-A de VEGFR-1 haciendo que estuviese disponible para unirse a, y señalizar a través de VEGFR-2 (Park et al., J Biol Chem. 269:25646-25654, 1994) . Datos in vivo de ratones modificados genéticamente sugirieron además un papel de señuelo sin señalización para VEGFR-1. Ratones VEGFR-1-/- morían in utero entre los días 8, 5 y 9, 5 y aunque desarrollaban células endoteliales, no podían organizarse en canales vasculares (Fong et al., Development 126:3015-3025, 1999) . La mortalidad se atribuyó a una proliferación de angioblastos excesiva y esto, a su vez, se atribuyó a una acción de VEGF-A potenciada (Fong et al., 1999 citado anteriormente) . La observación de que ratones que expresan VEGFR-1 que carece del dominio cinasa estaban sanos y no mostraban defecto manifiesto en el desarrollo vascular proporcionó apoyo adicional a la hipótesis del señuelo, ya que el receptor truncado podía unirse todavía a VEGF-A, pero no transmitir señales intracelulares (Hiratsuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4:9349-9354, 1998) .

El análisis de ratones VEGF-B-/- tampoco ha podido resolver la confusión que rodea al papel fisiológico (y patológico) preciso de ligandos específicos de VEGFR-1 y la señalización de VEGFR-1. En contraposición a ratones VEGF-A-/-, los ratones VEGF-B-/- no presentan defectos manifiestos en el desarrollo vascular y son sanos y fértiles (Bellomo et al., Circ. Res. 86:E29-E35, 2000) . En un informe, los corazones de ratones VEGF-B-/- tenían un tamaño reducido y la respuesta a la oclusión coronaria y la recuperación del miocardio de la isquemia estaban comprometidas (Bellomo et al 2000, citado anteriormente) . Aunque la morfología del corazón parecía normal, los autores concluyeron que VEGF-B es esencial para el establecimiento de una vasculatura coronaria funcional. En contraposición, un segundo informe que describe ratones VEGF-B-/- notificó sólo un defecto de la conducción... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo anti-VEGF-B aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe la unión de VEGF-B a VEGFR-1, en el que el anticuerpo se une a VEGF-B humano con un valor de KD de 1 x 10-7 M o menos, en el que el

anticuerpo reacciona de manera cruzada con VEGF-B humano y VEGF-B murino, y en el que el anticuerpo comprende una cadena ligera con CDR que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 5 a 7, y una cadena pesada con CDR que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 8 a 10.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 10

3. Anticuerpo según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo está humanizado.

4. Anticuerpo anti-VEGF-B aislado según la reivindicación 3 que comprende una secuencia de cadena ligera variable

y una cadena pesada variable que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 29 y 30. 15

5. Fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1, en el que el fragmento de unión a antígeno se selecciona de un fragmento Fv, Fab o F (ab’) 2, un fragmento Fv de cadena sencilla (sFv o scfv) , un fragmento Fv estabilizado por disulfuros (dsFv) , y minicuerpos y diacuerpos.

6. Composición que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF-B según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho 25 vector de expresión puede expresar dichos ácidos nucleicos en una célula huésped eucariota o procariota.

8. Vector de expresión según la reivindicación 7 que comprende una cadena ligera que codifica para una secuencia que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 31, 33 y 35 y una cadena pesada que codifica para una secuencia que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 37, 39 y 41.

9. Célula huésped eucariota o procariota aislada que comprende un vector de expresión según la reivindicación 7 u 8.

10. Método para producir un anticuerpo anti-VEGF-B según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,

comprendiendo dicho método (a) cultivar las células huésped aisladas según la reivindicación 9 durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo y (b) purificar el anticuerpo expresado.

11. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o composición según la reivindicación 6 para su uso en medicina. 40

12. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o composición según la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de cáncer en un mamífero.

13. Anticuerpo o composición para su uso según la reivindicación 12, en donde el cáncer es un tumor, un estado 45 precanceroso, un mieloma o un linfoma.

14. Anticuerpo o composición para su uso según la reivindicación 13, en el que el tumor se selecciona de tumores de mama, tumores colorrectales, adenocarcinomas, mesotelioma, tumores de vejiga, tumores de próstata, tumor de células germinales, hepatoma/colangiocarcinoma, tumores neuroendocrinos, neoplasia hipofisaria, tumor de células 50 redondas pequeñas, cáncer de células escamosas, melanoma, fibroxantoma atípico, seminomas, noseminomas, tumores de células de Leydig del estroma, tumores de células de Sertoli, tumores cutáneos, tumores de riñón, tumores testiculares, tumores cerebrales, tumores de ovario, tumores de estómago, tumores orales, tumores de vejiga, tumores óseos, tumores de cuello uterino, tumores de esófago, tumores de laringe, tumores hepáticos, tumores de pulmón, tumores vaginales y tumor de Wilm.

15. Anticuerpo o composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el cáncer es un tumor sólido.