METODO PARA LA REGENERACION DE NEURITAS A PARTIR DE NEURONAS ADULTAS Y ENVEJECIDAS DEL GANGLIO ESPIRAL.

Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas del ganglio espiral.



La presente invención se refiere a un método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas del ganglio espiral que incluye tanto una disociación mecánica como una enzimática con tripsina a 37°C, la adhesión de los explantes a superficies cargadas positivamente y un medio de cultivo acondicionado que incorpora suero de caballo, L-glutamina, los suplementos B27 y N2 simultáneamente y el factor de crecimiento GAP-43. La invención se puede aplicar en medicina regenerativa para solucionar problemas relacionados con hipoacusias y diferentes sorderas neurosensoriales incluida la presbiacusia

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200702012.

Solicitante: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MADRID.

Inventor/es: BARTOLOME PASCUAL,MARIA VISITACIO.

Fecha de Solicitud: 19 de Julio de 2007.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 22 de Febrero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N5/06B8B

Clasificación PCT:

  • C12N5/0793 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Neuronas.

Fragmento de la descripción:

Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas del ganglio espiral.

Objeto de la invención

La presente invención según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un método específico para regenerar neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas del ganglio espiral en condiciones in vitro.

Esta invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina y, más concretamente, dentro de la medicina regenerativa del sistema auditivo.

Estado de la técnica

Alteraciones en el receptor auditivo

La presbiacusia se define como la pérdida de audición progresiva y bilateral, generalmente simétrica, relacionada directamente con el envejecimiento del sistema auditivo.

La pérdida progresiva de la audición no es una alteración única, existen al menos cuatro tipos diferentes de presbiacusia:

a. presbiacusia sensorial: atrofia y degeneración de las células ciliadas.
b. presbiacusia neurosensorial: degeneración de las neuronas del ganglio espiral. Afectación de la inteligibilidad del lenguaje.
c. presbiacusia metabólica: alteración de la secreción y composición de la endolinfa. Pérdida global de audición.
d. presbiacusia mecánica o de conducción: alteración de los sistemas mecánicos de transducción de la onda sonora.

La presbiacusia neurosensorial en el ser humano conlleva no sólo una incapacidad de compresión e interpretación de los sonidos agudos sino también una importante alteración en la percepción e interpretación de los sonidos de frecuencias medias para la discriminación del habla, teniendo en cuenta que en individuos normooyentes el área de conversación se encuentra en las frecuencias medias (alrededor de 60 decibelios). Ésta pérdida de audición está estrechamente relacionada con el procesado, interpretación y transmisión del lenguaje, interactuando de forma impredecible, con alteraciones de personalidad, de motivación, de inhabilidades concretas, de aislamiento social y por tanto generando condicionantes desfavorables a nivel social y familiar.

Desde el punto de vista epidemiológico la presbiacusia es la segunda patología del anciano con mayor prevalencia, después de la artritis. Las afecciones del oído ocupan el tercer lugar en frecuencia, mientras que las afecciones relacionadas con la visión se sitúan en novena posición. Las estadísticas sobre la población con problemas auditivos en general no son nunca reales y siempre tienden a ser porcentajes muy inferiores, ya que en general las personas con deficiencias auditivas son reticentes a admitir que tiene este tipo de dificultad. Estudios realizados en 1994 sobre las situaciones crónicas de la vejez en USA pusieron de manifiesto que 4 de cada 5 individuos presentaban una audición deficiente. El envejecimiento de la población española es muy rápido, en estos últimos treinta años, se ha duplicado el número de personas mayores, representando este grupo social el 16,8% del total de la población nacional. En consecuencia, la presbiacusia en la sociedad española empieza a ser una de las causas más frecuentes en la consulta de Otorrinolaringología.

La presbiacusia se incluye dentro del amplio grupo de patologías de tipo degenerativo que se originan durante el envejecimiento natural o fisiológico del organismo. Una de las causas principales de la presbiacusia es la pérdida de las neuronas del ganglio espiral. Las razones por las que estas neuronas degeneran con la edad son aún desconocidas.

El sistema sensorial para la recepción e interpretación del sonido está subdividido en dos partes: la cóclea y la vía auditiva. La onda sonora captada por el oído externo y transportada al oído medio alcanza la cóclea, donde esta onda sonora, a través del sistema sensorial, transforma la onda sonora en un mensaje neurosensorial. Este mensaje neurosensorial, conducido a través de la vía auditiva, es analizado e interpretado en la corteza auditiva. La vía auditiva está formada por diferentes núcleos ubicados en protuberancia (núcleos cocleares, complejo olivar superior), mesencéfalo (lemnisco y colículo inferior), diencéfalo (cuerpo geniculado medial) y corteza auditiva. Estos núcleos conectados entre sí generan un complejo sistema de comunicación entre el receptor periférico y la corteza auditiva.

La cóclea se encuentra alojada dentro del peñasco del hueso temporal, el receptor periférico y el ganglio espiral se disponen alrededor del hueso modiolo o columnela, lo que dificulta considerablemente el estudio de esta estructura en el animal adulto. La cóclea o caracol es una estructura helicoidal formada por el sistema receptor periférico y el ganglio espiral. El receptor periférico está constituido por diferentes tipos celulares, entre los que se encuentran las células sensoriales denominadas células ciliadas externas e internas. Son estas células sensoriales las que contactan con las neuronas del ganglio espiral que a su vez envían el mensaje a la vía auditiva.

El modelo experimental en el estudio del envejecimiento del receptor auditivo

El receptor auditivo es una estructura muy sensible a la hipoxia, bastan escasos minutos para que degenere la estructura una vez aislada del individuo. Esta propiedad hace que los resultados de regeneración obtenidos con humanos sean escasos debido a la gran dificultad que supone trabajar con cócleas procedentes de biopsias y/o autopsias.

El estudio del envejecimiento del receptor auditivo requiere un animal de experimentación adecuado, en el que las alteraciones estructurales y funcionales observadas en relación con la edad sean concluyentes en el hombre. La anatomía y fisiología del oído presentan muchas similitudes entre las distintas especies de mamíferos, más concretamente las características morfofuncionales entre el oído de ratón y humano son muy similares. En la actualidad se utiliza muy frecuentemente para estudios de envejecimiento del receptor auditivo la cepa de ratón C57BL/6J por presentar un envejecimiento neurosensorial precoz de manera que, a los doce meses de vida, este ratón ya presenta signos de alteraciones morfológicas y fisiológicas relacionadas con la sordera. Estas alteraciones son muy similares a las observadas en humanos.

En el análisis de las cócleas procedentes de cualquier modelo de sordera experimental, incluyendo el envejecimiento prematuro del receptor auditivo (presbiacusia), siempre se ha observado el mismo patrón degenerativo. Las primeras células que se alteran y desaparecen son las células de Hensen, posteriormente las células ciliadas externas desaparecen. La degeneración y desaparición del túnel de Corti y las células ciliadas internas preceden a la degeneración y muerte de neuronas en el ganglio espiral.

Se han generado experimentalmente patologías auditivas en roedores (ratas y ratones) utilizando diferentes procedimientos como:

1. Sorderas genéticas por alteraciones de genes o proteínas en ratones transgénicos.
2. Sorderas por inducción de hipotiroidismo experimental.
3. Sorderas ototóxicas por tratamiento con drogas o antibióticos.
4. Sorderas por trauma acústico sometiendo los animales durante horas a ruido con alta intensidad.
5. Presbiacusia neurosensorial en diferentes mamíferos incluido el hombre.

En todas las sorderas neurosensoriales, patologías experimentales y biopsias humanas analizadas siempre se observa que el complejo sistema de células sensoriales y células de soporte que conforman el receptor auditivo es sustituido por un epitelio cicatricial, unicelular plano y no funcional. A nivel de ganglio espiral un cierto número de neuronas nunca degeneran aunque el receptor auditivo haya sido sustituido por un epitelio no funcional (Bartolomé M.V. y cols. (2001) NeuroReport 12, 3107-3110).

Regenerar neuritas a partir de neuronas envejecidas del ganglio espiral

El envejecimiento y las posibles modificaciones genéticas y moleculares que sufren las células antes de morir está siendo motivo de diferentes estudios multidisciplinares en diferentes estirpes celulares, en diferentes órganos y sistemas. La medicina regenerativa es un nuevo campo de la investigación en biomedicina que pretende regenerar el daño celular que conlleva la pérdida de la función y posterior muerte...

 


Reivindicaciones:

1. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral que comprende los siguientes pasos:

a. obtención de explantes por disociación mecánica rápida de la cóclea en presencia de EDTA calentado a 37ºC y disociación enzimática con tripsina y EDTA a 37ºC durante 5-15 minutos, e inhibición de la tripsina con suero de caballo a 37ºC durante 10-20 minutos.
b. adhesión de los explantes a una superficie cargada positivamente mediante una primera solución que incluye fibronectina, colágeno y laminina en tampón D-PBS (+CaCl2+MgCl2) y polimeriza en frío, una segunda solución que incluye poli-L-lisina en medio de cultivo Neurobasal ATM y polimeriza a temperatura ambiente o en calor, y la colocación del explante de manera que los restos de hueso queden alejados del sustrato.
c. cultivo de los explantes en un medio de cultivo acondicionado que incluye: suero de caballo, los suplementos B27 y N2, complejo formado por: insulina+ transferrina+ selenio, L-glutamina, glucosa simultáneamente y los factores de crecimiento Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF), Fibroblast Growth Factor (FGF), hbox{Recombinant Human Insulin Growth Factor I (GF-I), Murine Nerve Growth Factor (NGF).}
d. proliferación de neuritas en presencia de Brain Derived Growth Factor (BDNF), Neutrophin 3 (NT-3) y Growth Associated Protein- 43 (GAP-43).

2. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 1, caracterizado porque la disociación enzimática con tripsina y EDTA a 37ºC se realiza durante 10 minutos.

3. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la disociación enzimática la inhibición de la tripsina con suero de caballo se realiza durante 10 minutos.

4. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 1, caracterizado porque la polimerización de fibronectina, laminina, colágeno para la adhesión del explante se realiza a 8ºC durante 24 horas.

5. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 1, caracterizado porque la poli-L-lisina polimeriza a 37ºC durante 8 horas.

6. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de los factores de crecimiento utilizados es entre 10 y 100 ng/ml de medio de cultivo acondicionado.

7. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 6, caracterizado porque la concentración de Brain Derived Growth Factor (BDGF) es de 40 ng/ml de medio de cultivo acondicionado.

8. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 6, caracterizado porque la concentración de Growth Associated Protein-43 (GAP-43) es de 25 ng/ml de medio de cultivo acondicionado.

9. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de glucosa en el medio de cultivo acondicionado es entre 0,5 y 1%.

10. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 9, caracterizado porque la concentración de glucosa en el medio de cultivo acondicionado es de 0,6%.

11. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de glutamina en el medio de cultivo acondicionado es entre 0,5 y 1%.

12. Método para la regeneración de neuritas a partir de neuronas adultas y envejecidas de ganglio espiral, según la reivindicación 11, caracterizado porque la concentración de glutamina en el medio de cultivo acondicionado es del 1%.

13. Uso del método descrito en las reivindicaciones anteriores para obtener neuritas con las que fabricar implantes para el tratamiento de sorderas neurosensoriales en mamíferos.

14. Uso según reivindicación 13, donde las sorderas neurosensoriales son hipoacusias.


 

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