MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE REPERTORIOS COMPLEJOS DE MOLÉCULAS RECOMBINANTES.

La presente invención describe un método de producción de repertorios complejos de moléculas recombinantes de forma consistente y reproducible,

mediante la generación de forma transitoria de plantas multi-transgénicas que dan lugar a mosaicos somáticos inducidos por replicones virales que se excluyen entre sí. La presente invención también hace referencia a la planta multi-transgénica o un fragmento de la misma así obtenida, así como a los extractos o fracciones purificadas de las mismas que representen repertorios complejos de moléculas recombinantes, preferentemente proteínas recombinantes seleccionadas entre: enzimas, inmunoglobulinas, receptores de membrana, receptores intracelulares, lectinas, anticuerpos policlonales, antivenenos basados en antisueros, sueros inmunológicos para inmunidad pasiva, e inmunoglobulinas intravenosas.

Método de producción de repertorios complejos de moléculas recombinantes SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra dentro de la tecnología «biotecnología agrícola", siendo aplicable en la producción de conjuntos de moléculas recombinantes en los sectores químico, fannacéutico, veterinario y agrícola.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

En la actualidad existe una demanda creciente de moléculas recombinantes, para su uso en distintos sectores como el farmacéutico, veterinario, energético, etc. Muchas de estas proteínas requieren de sistemas eucariotas para su producción. En la mayoría de los casos, el objetivo último de la técnica es la producción de una única proteína de composición homogénea, como por ejemplo un factor de crecimiento o un anticuerpo monoclonal, y por ello la mayoría de los sistemas actuales están adaptados a este fin. Sin embargo no se dispone de metodologías que permitan producir repertorios complejos de proteínas diferentes de manera tal que la composición final de la mezcla sea altamente reproducible.

Algunos ejemplos de conjuntos complejos de proteínas que la industria produce y/o utiliza son los anticuerpos policlonales, las inmunoglobulinas hiperinmunes, los sueros inmunológicos para inmunidad pasiva o los antivenenos basados en antisueros. En todos los casos citados, el conjunto comprende, en todo o en parte, el repertorio de secuencias aminoacídicas que conforma la respuesta inmune de uno o varios individuos. La respuesta inmune de los mamíferos basa gran parte de su eficacia en el hecho de que comprende un amplio repertorio (policlonal) de inmunoglobulinas (anticuerpos) distintas. De esta forma diferentes inmunoglobulinas reconocen diferentes regiones del patógenofantígenoltoxina garantizando una mayor adaptabilidad y capacidad de neutralización. Análogamente, los anticuerpos policlonales resultan más eficaces que los monoclonales en gran cantidad de aplicaciones terapéuticas, como la neutralización de toxinas y agentes infecciosos, o de diagnóstico como la detección de especímenes de composición poco definida (Bregenholt et al., 2006; Dunman and Nesin, 2003; Haurum, 2006; Koefoed et al., 2006; Sharon et al., 2000 ) .

A pesar de las ventajas inherentes a la polidonalidad, la producción de repertorios complejos de proteínas de foona recombinante ha sido poco abordada debido a su complejidad técnica. Prueba de ello es que en la actualidad los anticuerpos recombinantes comerciales son monoclonales. En aquellas aplicaciones donde es necesario el uso de repertorios complejos, como en el caso de anticuerpos policlonales para diagnóstico, los antivenenos basados en antisueros, las inmunoglobulinas intravenosas para el tratamiento de inmunodeficiencias o las inmunoglobulinas hiperinmunes para terapias de inmunización pasiva, se recurre a producirtos de foona tradicional (no recombinante) , mediante inmunización y posterior aislamiento y purificación de sueros policlonales en animales (ratón, conejo, cabra o caba llo, entre otros) o humanos Los anticuerpos policlonales, los antivenenos basados en antisueros y otros productos inmunológicos para inmunidad pasiva obtenidos a partir de animales inmunizados presentan los siguientes problemas: (i) plantean problemas éticos en su manufactura; (ii) tienen alta variabilidad entre lotes, debido a las diferencias de respuesta inmunológica de distintos individuos (iii) requieren una exhaustiva caracterización de novo en cada lote (iv) presentan riesgos de inmunogenicidad y transmisión inadvertida de patógenos cuando su uso es terapéutico Por su parte las inmunoglobulinas intravenosas para el tratamiento de inmunodeficiencias y las inmunoglobulinas hiperinmunes para terapias de inmunización pasiva se obtienen a partir de plasma sanguíneo de donantes humanos y su suministro es limitado. No existe alternativa recombinante en la actualidad

Los problemas que presenta la obtención/producción/utilización de anticuerpos policlonales, antivenenos basados en antisueros, sueros inmunológicos para inmunidad pasiva obtenidos a partir de animales inmunizados, o las inmunoglobulinas intravenosas para el tratamiento de inmunodeficiencias y las inmunoglobulinas hiperinmunes para terapias de inmunización pasiva que se obtienen a partir de plasma sanguíneo de donantes humanos, se podrían solventar mediante la producción recombinante de repertorios complejos de anticuerpos policlonales. Sin embargo, existen numerosos problemas técnicos que limitan esta posibilidad. Se han desarrollado algunas estrategias en este sentido basadas en animales transgénicos. Tal es el caso de los ratones transgénicos a los que se les ha introducido los loci de inmunoglobulinas humanas (US 6, 111, 166) , los cuales pueden producir anticuerpos policlonales humanos mediante técnicas convencionales de inmunización. Sin embargo este sistema produce cantidades mínimas de anticuerpos debido al pequeño tamaño de los animales. También se han obtenido animales transgénicos de mayor tamaño como vacas (Kuroiwa et al., 2002)

Sin embargo los animales transgénicos tienen ciertos inconvenientes. En primer lugar, la inestabilidad de los loci de inmunoglobulinas compromete a largo plazo la producción de anticuerpos. En segundo lugar, es difícil eliminar las inmunoglobulinas del propio animal. En tercer lugar, los animales transgénicos no están exentos del riesgo de transmisión inadvertida de patógenos. Por último, la composición de la mezcla no es enteramente reproducible pues dependerá de las condiciones inmunofisiológicas del animal.

Una alternativa a los animales transgénicos consiste en producir anticuerpos policlonales recombinantes a partir de secuencias variables de inmunoglobulinas obtenidas de individuos con una respuesta inmune establecida, utilizando células de mamífero como plataforma de producción. Esta tecnología utiliza líneas celulares de mamíferos adaptadas para conseguir una integración sitio-específica de cada uno de los transgenes que constituyen la muestra (Bregenholt et al., 2006; Haurum, 2006; Klitgaard et al., 2006; Koefoed et al., 2011; Koefoed et al., 2006; Pedersen et al., 2010; Wiberg et al., 2006) . Esto elimina la variabilidad de expresión debida al efecto posicional del transgén y facilita la producción de mezclas reproducibles de anticuerpos policlonales con alta consistencia lote a lote a escala industrial (WO 2004/061104) .

Más recientemente se ha desarrollado un protocolo que mediante selección individual de clones estables de células de mamifero transformadas mediante inserciones al azar permite producir mezclas policlonales con reproducibilidad lote a lote (WO 2008/145133) . Sin embargo, estas metodologías requieren un proceso laborioso de selección de clones individuales estables, por lo que es poco adecuada para mezclas policlonales de alta complejidad. Además los sistemas basados en células de mamífero tienen altos costes de inversión, producción, y escalado industrial, lo que hace atractivo el uso de plataformas alternativas que reduzcan los costes Un grupo de plataformas alternativas particularmente interesante son aquellas basadas en plantas. Las plantas se utilizan como biofactorías de proteinas de muy distinta índole utilizando para ello, entre otras metodologias, virus recombinantes (Orzaez et al., 2009) . Existen numerosos ejemplos de virus vegetales que han sido adaptados a la producción de proteínas recombinantes en plantas (Gleba et al., 2004) . Para ello el virus silvestre se somete a una serie de modificaciones tendentes a convertirlo en un vector viral, esto es, un ácido nucleico, generalmente de naturaleza plasmídica capaz de transferir a la célula unidades autoreplicativas que albergan la secuencia que codifica la proteína de interés. Una de las principales ventajas del uso de vectores virales es que su capacidad autoreplicativa permite amplificar el número de copias del transgen en la célula, lo que favorece la obtención de altísimos niveles de producción recombinante. En la actualidad existen numerosos vectores virales siendo explotados por laboratorios académicos y empresas biotecnológicas (por ejemplo WO 051049S39, WO

06/079546 ) .

Hasta el momento, los vectores virales se han utilizado para la producción de productos homogéneos, como anticuerpos monoclonales, algunos de los cuales se encuentran en fases de ensayos clínicos. Un precedente en el intento de avanzar hacia la producción de mezclas policlonales de anticuerpos basándose en sistemas virales de plantas aparece en un trabajo desarrollado por Julve el al., 2011 (resumen de tesis de Másler, Universidad Politécnica de Valencia) . En concreto, se hace referencia a la producción de una mezcla policlonal de Nanobodies (VHHs) usando hojas de Nicotiana benthamiana. Sin embargo... [Seguir leyendo]

Método para la producción de al menos un repertorio complejo de N moléculas recombinantes, caracterizado por comprender los siguientes pasos:

i) ensamblar una colección de N secuencias nucleotidicas distintas en un vector viral de destino de forma tal que se genere una colección de N clones virales;

ii) transferencia de la colección de clones virales de forma conjunta y simultánea a una planta huésped,

iii) generación de una planta transitoriamente multi-lransgénica estructurada en forma de mosaico somático donde más del 80% de las células expresan exclusivamente una de las N moléculas recombinantes, o bien la expresan muy mayoritariamente, en una proporción molar que supone al menos el 80% del lotal de N moléculas recombinantes producidas en esa misma célula

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado por que las N moléculas recombinantes son N proteinas recombinantes

3. El método según las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que el vector viral de destino del paso ii) se encuentra en forma de un clan infectivo insertado en un vector binario y utiliza la transformación transitoria basada en Agrobacterium tumefaciens como mecanismo de entrada en las células de la planta huésped.

4. El método según la reivindicación 3, caracterizado por que el vector viral está desprovisto de su función de movimiento sistémico

5. El método según la reivindicación 4, caracterizado por que el vector viral se hace llegar a las células de la planta huésped mediante un sistema mecánico

El método según la reivindicación 5, caracterizado por que el sistema mecánico se selecciona de entre el siguiente grupo: infiltración a vacio, infiltración por sobrepresión y espray.

7. El método segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caraclerizado por que las N secuencias nucleotídicas del paso i) codifican al menos una variante de secuencia de una familia de proteinas

8. El método según la reivindicación 6, caracterizado por que la familia de proteinas se selecciona de entre el siguiente grupo: enzimas, inmunoglobulinas, receptores de membrana, receptores intracelulares, y lectinas.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, combinado con un sistema de expresión Sin interferencia homóloga.

El método segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado por que las N secuencias nucleotídicas del paso i) codifican al menos una secuencia variable de al menos una inmunoglobulina.

. El método según la reivindicación 10, caracterizado por que la inmunoglobulina es producida por linfocitos obtenidos a partir de animales inmunizados frenle a un antigeno 12 El método segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado por que las N secuencias nucleotídicas del paso i) cod ifican al menos una secuencia variable de al menos una inmunoglobulina o su fragmento, seleccionados mediante una técnica de selección in vitro de anticuerpos recombinantes.

Uso del método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para producir de forma recombinante una mezcla compleja de homopolímeros.

14. Uso del método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para producir de forma recombinante una mezcla compleja de heteropolimeros.

15. Una planta transitoriamente multi-transgénica o un fragmento de la misma, caracterizada por que es obtenida en el paso iii) del método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

La planta o el fragmento de la misma según la reivindicación 15, caracterizada por que expresa, al menos un repertorio complejo de anticuerpos policlonales

17. La planta o el fragmento de la misma según la reivindicación 16, caracterizada por que los anticuerpos policlonales son similares a los producidos por un animal o un grupo de animales en respuesta a un proceso de inmunización frente a un antígeno, un grupo de antígenos o un agente patógeno

18. Un extracto crudo obtenido de una planta descrita en cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

19. Una mezcla purificada o parcialmente purificada de anticuerpos obtenidos a partir de un extracto descrito 5 en la reivindicación 18

20. Un repertorio complejo de N moléculas recombinantes caracterizado por que se produce mediante el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

21. El repertorio según la reivindicación 20, caracterizado por que las N moléculas recombinantes son N proteinas recombinantes 22. El repertorio según la reivindicación 21 , caracterizado por que las N proteinas recombinantes se seleccionan de entre el siguiente grupo: enzimas, inmunoglobulinas, receptores de membrana, receptores intracelulares, lectinas, anticuerpos policlonales, antivenenos basados en antisueros, sueros inmunológicos para inmunidad pasiva, e inmunoglobulinas intravenosas.