MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN EN MASA DE LA REGIÓN CONSTANTE DE INMUNOGLOBULINA.

Método para la producción en masa de la región constante de inmunoglobulina Campo Técnico La presente invención se relaciona con un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de señal de enterotoxina II estable al calor E. coli y una secuencia de nucleótido que codifica un región constante de inmunoglobulina, un transformante transformado con el vector de expresión, y un método para producción en masa de una región constante de inmunoglobulina al cultivar el transformante y expresar la región constante de inmunoglobulina en una forma soluble en agua. Técnica Antecedente Con los avances en la ingeniería genética, se han preparado y utilizado una gran número de fármacos de proteínas. Sin embargo, los fármacos de proteínas son susceptibles a desnaturalización o degradación proteolítica en el cuerpo, y es difícil sostener las concentraciones in vivo y títulos durante un largo periodo de tiempo. Es importante desarrollar una técnica para mantener las concentraciones in vivo de los fármacos de proteínas en niveles adecuados al mejorar la estabilidad de la proteína para promover la eficacia de la terapia, para ayudar a los pacientes que necesitan tomar su fármaco de proteína en inyecciones frecuentes y reducir el coste del tratamiento. Se han hecho muchos intentos para mejorar la estabilidad in vivo de los fármacos de proteínas durante un largo tiempo, y tales intentos incluyen el cambio de una formulación de proteína, fusionar una proteína con otra proteína, o adherir químicamente o biológicamente un polímero adecuado a la superficie de una proteína. Una de tales técnicas es elaborar una proteína de fusión con el fragmento Fc de inmunoglobulina. El fragmento Fc media las funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC), así como también la capacidad de unión a antígeno que es la función única de las inmunoglobulinas. También, el fragmento Fc contiene una secuencia que participa en la unión al receptor Fc neonatal (FcRn), que cumple una función en la regulación de los niveles IgG de suero al incrementar el transporte del IgG maternal a los neonatos y la vida útil del IgG (Ghetie and Ward, Immunology Today 18: 592-598, 1997), y la secuencia regula la interacción entre la proteína A y la proteína G. A través de la fusión de este fragmento Fc con una proteína terapéutica, se han realizado muchos estudios para mejorar la estabilidad de la proteína terapéutica. Por ejemplo, la Patente Coreana No. 249572 describe una proteína de fusión que se prepara al ligar una región constante de cadena pesada IgG1 (Fc) en un extremo de terminal amino del mismo a un extremo de terminal carboxilo de una proteína, tal como el receptor IL4, receptor IL7, receptor G-CSF o receptor EPO, y producir la proteína de fusión resultante en células de mamífero. La Patente Estadounidense No. 5,605,690 describe una proteína de fusión que comprende el receptor del factor de necrosis de tumor fusionado en su extremo de terminal carboxilo a un derivado Fc IgG1 humano, la proteína de fusión se produce en células de animal. También, Tanox Inc. reporta en la Patente Estadounidense Nos. 5,723,125 y 5,908,626 que una molécula híbrida comprende interferón alfa o beta humano ligado a su extremo de terminal carboxilo al Fc humano natural a través de un ligador de péptido y se produce en células de animal. Lexigen Inc., como describe en la Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO 00/69913, prepara un Fc IgG1 natural ligado a su extremo de terminal carboxilo al extremo de terminal amino de interferón humano mediante recombinación genética sin el uso de un ligador y produce la proteína de fusión en células de animal. La Publicación de Patente Estadounidense No. 20030082679 describe una proteína de fusión con una vida útil de suero extendida, que comprende G-CSF humano ligado a su extremo de terminal carboxilo al extremo de terminal amino de Fc IgG1 y se produce en células de animal. La Publicación de Patente Estadounidense No. 20010053539, Patente Estadounidense No. 6,030,613, la Publicación de Solicitud PCT Internacional Nos. WO 99/02709 y WO 01/03737 y Patente Europea No. 0464533B1 describe una proteína de fusión Fc con una vida útil de suero mayor que una proteína natural, que comprende un Fc IgG1 o derivado Fc ligado a su extremo de terminal amino a través de un ligador de péptido o sin un ligador de péptido al extremo de terminal carboxilo del EPO humano, TPO, hormona de crecimiento humana o interferón humano beta, la proteína de fusión Fc se produce en células de animal. Estas proteínas de fusión Fc, como se describió anteriormente, aumentan la vida útil del suero de una proteína objetivo, pero son problemáticas en términos de mediar las funciones efectoras mediante el fragmento Fc (Patente Estadounidense No. 5,349,053). A través de las funciones efectoras del fragmento Fc, fijan los complementos o se unen a las células que expresan los FcyR, que conducen a lisis de las células específicas, e inducen la producción y secreción de diversas citoquinas que inducen la inflamación, que conduce a inflamación indeseada. También, la fusión crea una nueva secuencia de aminoácidos en una región de conexión entre el fragmento Fc y el socio de 2   proteína, que puede inducir potencialmente las respuestas inmunes luego de la administración durante un largo periodo. A este respecto, se han hecho muchos esfuerzos para preparar una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina que tiene una vida útil del suero mayor pero que es deficiente en funciones efectoras. Cole et al. reporta que, cuando los residuos de aminoácido de la región CH2 en las posiciones 234, 235 y 237, se conocen por cumplir una función importante en la unión a los receptores Fc, que se reemplazan con alanina para producir un derivado Fc que tiene una afinidad de unión reducida a los receptores Fc, se inhibe la actividad ADCC (Cole et al., J. Immunol. 159: 3613-3621, 1997). Sin embargo, en todas estas variantes, el Fc puede haber incrementado la inmunogenicidad o antigenicidad comparado con el fragmento Fc humano natural debido a la presencia de aminoácidos inadecuados y puede perder las funciones Fc preferibles. Entre los métodos para eliminar o reducir las funciones efectoras indeseables mientras se mantienen altas concentraciones de suero de una inmunoglobulina, una se basa en la remoción de unidades estructurales de azúcar de la inmunoglobulina. Como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,585,097, se puede preparar un derivado de anticuerpo aglucosilado como un anticuerpo anti-CD3 al reemplazar una residuo glucosilado de anticuerpos, el residuo asparagina en la posición 297 del dominio CH2, con otro aminoácido. Este derivado de anticuerpo aglucosilado exhibe funciones efectoras reducidas, pero aún retiene su afinidad de unión al receptor FcRn sin cambio de la vida útil del suero. Sin embargo, este derivado también es problemático en términos de que se reconoce potencialmente como un material extraño y es rechazado por el sistema inmune debido a la producción de una construcción recombinante novedosa que tiene una secuencia anormal. La Publicación de Patente Estadounidense No. 20030073164 describe un método para producir un derivado Fc utilizando E. coli desprovisto de la capacidad de glucosilación con el fin de preparar un anticuerpo terapéutico deficiente de las funciones efectoras. La compañía Estadounidense Amgen Inc. describe, en la Patente Estadounidense No. 6,660,843 y la Publicación de Patente Estadounidense Nos. 20040044188 y 20040053845, un derivado Fc IgG1 humano que tiene eliminaciones de aminoácido en los primeros cinco residuos de aminoácido de la región bisagra, que se fusiona al extremo de terminal amino o carboxilo de una proteína terapéutica o una proteína terapéutica imitada por un péptido, y la producción del mismo utilizando un anfitrión E. coli. Sin embargo, esta proteína de fusión no tiene una secuencia de señal que se expresa como cuerpos de inclusión y así se puede someter a un proceso de replegado adicional. Este proceso de replegado de la proteína reduce los rendimientos, y especialmente en una proteína presente como un homodímero o un heterodímero, reduce notablemente la producción de dímero. También, cuando una proteína no tiene una secuencia de señal que se expresa en E. coli, se agrega un residuo metionina al terminal N del producto de expresión debido a la característica del sistema de expresión de la proteína de E. coli. Los productos de expresión mencionados anteriormente de Amgen Inc. tienen un residuo de metionina de terminal N, que puede inducir respuestas inmunes luego de la administración repetida o excesiva al cuerpo.... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una región constante de inmunoglobulina, que comprende: transformar una célula procariótica con un vector de expresión recombinante que incluye una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de señal de enterotoxina II estable al calor y una secuencia de nucleótido que codifica una región constante de inmunoglobulina; cultivar un transformante resultante; y aislar y purificar la región constante de inmunoglobulina producida por el transformante, en donde la región constante de inmunoglobulina se expresa en el citoplasma en forma soluble en agua. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región constante de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste de las regiones constantes de IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, y combinaciones e híbridos de los mismos. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el IgG se selecciona del grupo que consiste de las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y combinaciones e híbridos de los mismos. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la región constante de inmunoglobulina es una región constante IgG4. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la región constante de inmunoglobulina es una región constante IgG4 aglucosilada humana. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región constante de inmunoglobulina se compone de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste de CH1, CH2, CH3, CH4 y los dominios CL. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la región constante de inmunoglobulina comprende adicionalmente una región bisagra. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótido que codifica una región constante de cadena pesada y una secuencia de nucleótido que codifica una región constante de cadena ligera. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región constante de inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos representado por la SEQ ID NO. 21, 22, 23, 24, 25, 27, 29, 30, 34 o 35. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido de señal de enterotoxina II estable al calor tiene una secuencia de aminoácidos representado por la SEQ ID NO. 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o 46. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el transformante es E. coli BL21/pSTIIGlCHl3 (HM10935; No. de Depósito KCCM-10600), BL2 1/pSTIIdCGlFc (HM10927; No. de Depósito KCCM-10588), BL21/pSTIIdGGlSFc (HM10928; No. de Depósito KCCM-10589), BL21/pSTIIdCGlSFFc (HM10929; No. de Depósito KCCM-10594), BL21/pSTIIGlMo (HM10930; No. de Depósito KCCM-10595), BL21/pSTIIdCG4Fc (HM10932; No. de Depósito KCCM-10597), BL21/pSTIIG4CHl3 (HM 10931; No. de Depósito KCCM-10596), BL21/pSTIIG4Mo (HM10933; No. de Depósito KCCM- 10598), o BL21/pSTIIG4HK (HM10934; No. de Depósito KCCM-10599). 12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el transformante es E. coli. 49     51   52   53   54