El uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

1 en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa, en la que SEQ ID NO: 1 es:

Método de producción de D-psicosa por D-psicosa epimerasa.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir D-psicosa usando una D-psicosa epimerasa (denominada en este documento de aquí en adelante, psicosa 3-epimerasa) derivada de Agrobacterium tumefaciens.

Antecedentes de la invención

De forma general, la D-psicosa es un epímero de la D-fructosa, y es muy similar a la D-fructosa en los aspectos de intensidad y tipo del dulzor. Sin embargo, a diferencia de la D-fructosa, la D-psicosa apenas es metabolizada durante la asimilación en el cuerpo, y tiene un bajo grado de contribución calórica. Por lo tanto, la D-psicosa puede usarse como un ingrediente eficaz de alimentos de dieta. Mientras que los alcoholes de azúcar, que son ampliamente usados como edulcorantes no azucarados, causan efectos secundarios tales como la diarrea cuando se ingiere más de una dosis estipulada, la D-psicosa no tiene ninguno de tales efectos secundarios. Además, la D-psicosa tiene un valor calórico de casi cero, ya que casi no es metabolizable por el cuerpo humano, y tiene la función de reducir las grasas abdominales suprimiendo la actividad de enzimas lipogénicas. Por lo tanto, la D-psicosa puede usarse como un edulcorante que también es provechoso en la reducción del peso (Véase, por ejemplo, Matsuo, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori y H. Suzuki, "Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats", Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10:233-237 (2001); y Matsuo, T. y K. Izumori, "D-Psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition", Asia Pac. J. Clin. Nutr., 13:S127 (2004)).

En este sentido, la D-psicosa atrae un gran interés como edulcorante alimenticio, y hay una demanda creciente en el ramo de la alimentación para el desarrollo de un método para producir la D-psicosa eficazmente. Esto es debido a que la D-psicosa sólo existe en una muy pequeña cantidad en la naturaleza como intermedio durante el proceso de tratamiento de theriae o reacción de isomerización de la glucosa, y no puede ser sintetizada por medios químicos.

Por lo tanto, a fin de afrontar tales problemas como se describen anteriormente, se están desarrollando investigaciones sobre métodos para producir enzimáticamente D-psicosa usando D-fructosa como sustrato.

Sin embargo, hay un problema en los métodos desarrollados hasta ahora, que los gastos de producción son altos, debido al bajo rendimiento de la D-psicosa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es una gráfica que muestra la actividad de psicosa 3-epimerasa frente al pH de reacción;

La figura 1B es una gráfica que muestra la actividad de psicosa 3-epimerasa frente a la temperatura de reacción;

La figura 2 es una gráfica que muestra las proporciones de equilibrio entre D-psicosa (-) y D-fructosa (Box) obtenidas cuando la psicosa 3-epimerasa se hace reaccionar con D-fructosa a temperaturas en el intervalo de 30ºC y 60ºC; y

La figura 3 es un mapa de división de un vector de expresión recombinante.

Descripción detallada de la invención

Los inventores de la presente invención hicieron un intento de seleccionar una enzima que pudiera producir la D-psicosa con un alto rendimiento usando D-fructosa como sustrato, a partir de enzimas de epimerasa que se caracterizaban no por la función, sino simplemente por la secuencia de bases o la secuencia de aminoácidos, y demostraron los efectos específicos de la enzima seleccionada. La presente invención proporciona un nuevo método para producir la D-psicosa con un alto rendimiento usando la enzima seleccionada.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, y que tiene una actividad de psicosa 3-epimerasa en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir D-psicosa haciendo reaccionar una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 con D-fructosa.

De aquí en adelante en este documento, la presente invención será descrita detalladamente.

Se sobrentiende que los términos técnicos y los términos científicos usados en este documento se refieren a los términos convencionalmente entendidos por los expertos ordinarios en la técnica, a menos que se establezca otra cosa.

Además, no serán repetidas las descripciones sobre constituciones técnicas y mecanismos que son idénticas a las constituciones técnicas y mecanismos convencionalmente conocidos.

Los presentes inventores investigaron las características de la tagatosa 3-epimerasa no caracterizada derivada de Agrobacterium tumefaciens clonando un gen de la tagatosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens o un gen correspondiente a la tagatosa 3-epimerasa, cultivando un microorganismo transformado con un vector de expresión que contiene el gen, y sobre-expresando la tagatosa 3-epimerasa. Consecuentemente, se encontró que la tagatosa 3-epimerasa tenía una especificidad más alta para la psicosa que para la tagatosa, y así, se demostró que la "supuestamente conocida" tagatosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens era realmente la psicosa 3-epimerasa. Así, la presente invención proporciona un método para producir la D-psicosa usando la psicosa 3-epimerasa.

Más expresamente, en una tentativa de obtener el gen de una conocida tagatosa 3-epimerasa útil para la presente invención, se usaron cepas bacterianas conocidas por producir el gen de la tagatosa 3-epimerasa, y las cepas bacterianas incluyen Thermotoga maritima, Streptomyces coelicolor, Mesorhizobium loti, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopirellula baltica, Pirellula sp., Photorhabdus luminescens subsp. laumondii y Sinorhizobium meliloti. Se demostró por primera vez por la presente invención que sólo la enzima (NP_355915; SEQ ID NO: 1) expresada a partir de un gen derivado de ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens tiene una actividad que puede convertir la D-fructosa en D-psicosa.

A fin de determinar las características de la tagatosa 3-epimerasa, en la presente invención, se obtuvieron los genes de tagatosa 3-epimerasa en grandes cantidades mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de cepas bacterianas que contienen genes de tagatosa 3-epimerasa que fueron designados simplemente según la secuencia de bases del ADN, no según los resultados de caracterización en el aspecto de la función enzimática. Después, los genes de tagatosa 3-epimerasa obtenidos se insertaron en los vectores de expresión apropiados para producir vectores recombinantes que contenían los genes de tagatosa 3-epimerasa, y los vectores recombinantes se transformaron dentro de los microorganismos apropiados. Los microorganismos transformados se cultivaron en medios de fermentación, y los productos proteicos de los genes de tagatosa 3-epimerasa se sobre-expresaron en los microorganismos. Los productos proteicos de los genes de tagatosa 3-epimerasa se aislaron entonces y se purificaron para su uso.

El método para producir la D-psicosa de la presente invención incluye hacer reaccionar una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que es la psicosa 3-epimerasa (conocida por lo general como la tagatosa 3-epimerasa) con D-fructosa usada como sustrato.

La psicosa 3-epimerasa empleada en la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos modificadas que resultan de la sustitución, introducción o deleción de algunos residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pueden ser capaces de convertir la D-fructosa en D-psicosa.

Un vector de expresión que puede usarse para producir un vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector de expresión convencionalmente usado en la tecnología de recombinación genética, y puede ser, por ejemplo, pET-24a(+). El microorganismo que puede transformarse con el vector de expresión recombinante puede ser BL21 (DE3) de E. coli. Sin embargo, el microorganismo no está limitado a condición de que sea cualquier cepa bacteriana que sea capaz de sobre-expresar el gen deseado, siendo transformado después con un vector...

1. El uso de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en la producción de D-psicosa a partir de D-fructosa, en la que SEQ ID NO: 1 es:

2. Un método para producir D-psicosa haciendo reaccionar la proteína definida en la reivindicación 1 con D-fructosa.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la proteína es un producto proteico obtenido cultivando un microorganismo transformado con el vector de expresión recombinante que comprende un gen que codifica una proteína, cuya proteína tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y aislando la proteína de la solución de cultivo del microorganismo en el que SEQ ID NO: 1 es:

4. El método de la reivindicación 2, en el que la reacción se realiza en presencia de un ión metálico seleccionado entre el grupo que consiste en manganeso, magnesio, hierro, cobalto y aluminio.

5. El método de la reivindicación 2, en el que la concentración de D-fructosa usada en la reacción está entre 55 y 75% (p/p).

6. El método de la reivindicación 2, en el que la reacción se realiza entre un pH de 7 y 8 y a una temperatura entre 55 y 65ºC.

7. El método de la reivindicación 2, en el que la proteína se hace reaccionar con D-fructosa estando inmovilizada sobre un vehículo.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el que el ión metálico está presente a una concentración entre 0,5 mM y 5 mM.