METODO DE PRODUCCION DE ADNC DE LONGITUD COMPLETA MEDIANTE LIGACION DE ADAPTADOR DE EXTREMO COHESIVO.

Método de producción de ADNc de longitud completa que comprende una etapa a) de desfosforilación de los fragmentos de ácidos nucleicos no provistos de un protector en 5'',

una etapa b) de supresión de la protección del extremo 5'' de los ARN protegidos, una etapa c) de ligación de oligonucleótidos en el extremo 5'' de ARN obtenidos en la etapa b) y una etapa d) de síntesis de los ADNc de longitud completa, mediante retro-transcripción de los ARN obtenidos en la etapa c), mediante una transcriptasa inversa, estando dicho método caracterizado porque la etapa c) de ligación del oligonucleótido se lleva a cabo mediante una ligasa y un adaptador bicatenario de extremo cohesivo, comprendiendo dicho adaptador bicatenario de extremo cohesivo una hebra superior que contiene un sitio 3''OH aceptor de ligasa para el acoplamiento con el 5'' de los ARN, y una hebra inferior que presenta en 5'' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria que puede aparearse con el extremo 5'' de los ARN

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2004/002722.

Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 3, RUE MICHEL ANGE,75016 PARIS.

Inventor/es: CLEPET,CHRISTIAN,YVES.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 23 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/10D

Clasificación PCT:

  • C07H21/02 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).

Clasificación antigua:

  • C07H21/02 C07H 21/00 […] › con ribosilo como radical sacárido.
  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).

Fragmento de la descripción:

Método de producción de ADNc de longitud completa mediante ligación de adaptador de extremo cohesivo.

La presente invención tiene por objeto un método de producción de ADNc de longitud completa mediante ligación de un oligonucleótido en el extremo 5' de un ARN gracias a un adaptador bicatenario de extremo cohesivo y una ligasa.

Técnica anterior

En biología molecular, el estudio de los ADNc de longitud completa sigue siendo un enfoque ineludible para determinar la estructura de los genes. La realización de librerías de ADNc de calidad constituye un preliminar indispensable en diferentes programas de investigación en genómica. El conocimiento de la secuencia completa de los transcritos permite, por ejemplo, elegir unas sondas de especificidad óptima para la constitución de chips de ADN, o en unos proyectos de análisis funcional mediante "gene silencing". Los constructos de ADNc que contienen la totalidad del marco de lectura permiten, por ejemplo, estudiar la estructura de la proteína, su localización celular, sus eventuales parejas, etc.

Un ADNc se denomina de longitud completa cuando cubre la totalidad de la secuencia de un transcrito. Esta terminología se utiliza habitualmente en el caso de los ARN mensajeros (ARNm) eucariotas para los cuales el ADNc de longitud completa contendrá en particular la región directamente corriente abajo del protector en 5'.

El aislamiento de los ADNc de longitud completa es una problemática difícil que ha inspirado un gran número de trabajos. El método ideal de producción de ADNc de longitud completa debe ser lo más específico posible del extremo 5' protegido de los ARN mensajeros con el fin de poder contra-seleccionar los ADNc truncados. En la práctica, esta ganancia de especificidad se realiza generalmente en detrimento de la eficacia global del protocolo, lo que puede ralentizar considerablemente la clonación de los ARN mensajeros más raros o inestables, o los más difíciles de convertir en ADN complementarios.

En el método de producción de ADNc de longitud completa de Sekine et al. (patente EP 0 625 572), después del tratamiento de la preparación de ARN mediante la fosfatasa alcalina, los ARNm se desprotegen mediante la pirofosfatasa ácida del tabaco, y se ligan a un oligonucleótido mediante la T4 ARN ligasa. Los ARN obtenidos se convierten a continuación en ADNc mediante una transcriptasa inversa.

En este protocolo, la producción de ADNc de longitud completa está limitada a nivel de la etapa de fijación del adaptador sobre el ARN; en efecto, el experto en la materia sabe que el empalme y la ligación de dos fragmentos de ácido nucleico monocatenarios presentan una eficacia reducida. Además, este procedimiento de etiquetado plantea unos problemas de especificidad debido a que cualquier extremo 3'OH presente en el medio de reacción puede servir de sustrato de ligación en lugar del adaptador, y conducir a la formación de quimeras u otros concatémeros y llegar de esta manera a la desactivación y a la pérdida de los ARNm más difíciles de clonar.

Descripción de la invención

De manera sorprendente e inesperada, los inventores han demostrado que el método de producción de ADNc de longitud completa de la presente invención permite resolver estos problemas mediante la utilización de un adaptador bicatenario de extremo cohesivo que crea una estructura bicatenaria a nivel de la unión con el ARN, y de una ligasa para la ligación de un oligonucleótido en el extremo 5' de los ARN. Los inventores han demostrado que dicho método permite aumentar la eficacia de la ligación. La utilización de adaptadores bicatenarios de extremo cohesivo aporta unas mejoras significativas para el posicionamiento del oligonucleótido a nivel del extremo 5' del ARN. La estructura bicatenaria generada a nivel de la unión con el ARN permite además catalizar la ligación por medio de la T4 ADN ligasa cuya constante de afinidad (10-8 M<Km<10-7 M para unos polinucleótidos en el seno de estructuras bicatenarias) es significativamente más baja que para la T4 ARN ligasa (Km>1 mM para unos polinucleótidos).

Además de una ganancia de eficacia, este método presenta una especificidad aumentada con relación al protocolo de Sekine et al. (patente EP 0 625 572). En este protocolo, cualquier polinucleótido que presenta un extremo 3'OH constituye un sitio aceptor potencial para la T4 ARN ligasa y puede, por lo tanto, ser fijado sobre el extremo 5' fosfato de los ARNm. Además de los problemas de ruido de fondo relacionados con la presencia de los concatémeros y otras quimeras que se pueden generar de esta manera, este tipo de evento puede conducir a la desactivación y a la pérdida de los transcritos más raros. La especificidad de ligación conferida por la T4 ADN ligasa que ejerce su actividad en unos "nicks" en el seno de estructuras bicatenarias, permite evitar este tipo de ruido de fondo.

Por último, se señalará que siendo la actividad de la T4 ARN ligasa más elevada en algunas secuencias que en otras, esto podría conducir a una representación desigual de los transcritos en los bancos de ADNc. Dicha desviación de secuencia no se ha descrito jamás para la T4 ADN ligasa.

El objeto de la presente invención es por lo tanto un método de producción de ADNc de longitud completa que comprende una etapa a) de desfosforilación de los fragmentos de ácidos nucleicos no provistos de un protector en 5', una etapa b) de supresión del extremo de la protección del extremo 5' de los ARN protegidos, una etapa c) de ligación de oligonucleótidos en el extremo 5' de ARN obtenidos en la etapa b) y una etapa d) de síntesis de los ADNc de longitud completa, mediante retro-transcripción de los ARN obtenidos en la etapa c), mediante una transcriptasa inversa, estando dicho método caracterizado porque la etapa c) de ligación del oligonucleótido se lleva a cabo mediante una ligasa y un adaptador bicatenario de extremo cohesivo, comprendiendo dicho adaptador bicatenario de extremo cohesivo una hebra superior que contiene un sitio 3'OH aceptor de ligasa para el acoplamiento con el 5' de los ARN, y una hebra inferior que presenta en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria que puede aparearse con el extremo 5' de los ARN.

La etapa a) se lleva a cabo de manera convencional, conocida por el experto en la materia y puede, entre otros, ser llevada a cabo mediante la fosfatasa alcalina (Maniatis et al., véase Techniques générales de biologie moléculaire).

La etapa b) se lleva a cabo de manera convencional, conocida por el experto en la materia y puede, entre otros, ser llevada a cabo mediante la pirofosfatasa ácida del tabaco.

La etapa d) se lleva a cabo de manera convencional, conocida por el experto en la materia y puede, entre otros, ser llevada a cabo mediante el apareamiento de un cebador en el extremo 3' de un ARN obtenido en la etapa c), la elongación 5'-3' del cebador mediante la transcriptasa inversa para formar la primera hebra de ADNc, la degradación de la hebra de ARN mediante un tratamiento alcalino, y la síntesis de la segunda hebra de ADNc mediante una ADN polimerasa dependiente de ADN. (Maniatis et al., véase Techniques générales de biologie moléculaire).

Mediante la expresión "ARN protegido", se entiende designar de manera preferida según la presente invención unos ARN mensajeros.

Por el término "ligasa" se entiende designar, según la presente invención, una ADN ligasa, una ARN ligasa o una combinación de ARN ligasa y de ADN ligasa.

De manera preferida, la ligasa utilizada según la presente invención es una ADN ligasa, y más particularmente la T4 ADN ligasa.

Mediante la expresión "adaptador bicatenario de extremo cohesivo" se entiende designar, según la presente invención, una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende una hebra superior que contiene un sitio 3'OH aceptor de ligasa para el acoplamiento con el 5' de los ARN, y una hebra inferior que presenta en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria que puede aparearse con el extremo 5' de los ARN.

De manera opcional, según la presente invención, la hebra inferior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo se puede bloquear mediante un grupo amina en 3'.

Mediante la expresión "adaptador bicatenario de extremo cohesivo constituido por una molécula de ácido nucleico" se entiende designar, según la presente invención, un adaptador bicatenario de extremo cohesivo constituido por ADN o por ARN o por una composición mixta de ADN/ARN.

 


Reivindicaciones:

1. Método de producción de ADNc de longitud completa que comprende una etapa a) de desfosforilación de los fragmentos de ácidos nucleicos no provistos de un protector en 5', una etapa b) de supresión de la protección del extremo 5' de los ARN protegidos, una etapa c) de ligación de oligonucleótidos en el extremo 5' de ARN obtenidos en la etapa b) y una etapa d) de síntesis de los ADNc de longitud completa, mediante retro-transcripción de los ARN obtenidos en la etapa c), mediante una transcriptasa inversa, estando dicho método caracterizado porque la etapa c) de ligación del oligonucleótido se lleva a cabo mediante una ligasa y un adaptador bicatenario de extremo cohesivo, comprendiendo dicho adaptador bicatenario de extremo cohesivo una hebra superior que contiene un sitio 3'OH aceptor de ligasa para el acoplamiento con el 5' de los ARN, y una hebra inferior que presenta en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria que puede aparearse con el extremo 5' de los ARN.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque los ARN protegidos son unos ARN mensajeros.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la ligasa utilizada en la etapa c) es una ADN ligasa, una ARN ligasa o una combinación de ARN ligasa y de ADN ligasa.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la ligasa utilizada es una ADN ligasa.

5. Método según las reivindicaciones 3 y 4, caracterizado porque la ligasa utilizada es la T4 ADN ligasa.

6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la hebra inferior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo se puede bloquear mediante un grupo amina en 3'.

7. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque las hebras superior e inferior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo pueden estar constituidas por ADN o por ARN o ser de composición mixta ADN/ARN.

8. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la hebra superior del adaptador bicatenario está compuesta por 24 desoxirribonucleótidos en 5' seguido de un fragmento de 8 ribonucleótidos en 3'.

9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la hebra inferior del adaptador bicatenario comprende en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria de 6 bases.

10. Método de ligación de un adaptador oligonucleotídico en el extremo 5' de un ARN, que comprende las etapas siguientes:

a)Obtener un ARN monocatenario que presenta un extremo 5' fosfato b)Preparar las dos hebras de un adaptador de extremo cohesivo que comprende una hebra superior que contiene un sitio 3'OH aceptor de ligasa para el acoplamiento con el 5' de los ARN, y una hebra inferior de extremo cohesivo que presenta en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria que puede aparearse con el extremo 5' fosfato de los ARN c)Mezclar dicha hebra superior con dicha hebra inferior de manera que forman un adaptador bicatenario d)Mezclar dicho adaptador con dicho ARN monocatenario para permitir que el extremo 5' de dicha hebra inferior se hibride con dicha hebra sencilla de ARN e)Ligar dicho adaptador con dicha hebra sencilla de ARN mediante una ligasa.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque el ARN monocatenario es un ARN protegido.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque el ARN protegido es un ARN mensajero.

13. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque el ARN monocatenario es un ARN no protegido.

14. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la ligasa utilizada en la etapa e) es una ADN ligasa, una ARN ligasa, o una combinación de ARN ligasa y de ADN ligasa.

15. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la ligasa utilizada es una ADN ligasa.

16. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la ligasa utilizada es la T4 ADN ligasa.

17. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la hebra inferior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo se puede bloquear mediante un grupo amina en 3'.

18. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque las hebras superior e inferior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo pueden estar constituidas por ADN o por ARN o ser de composición mixta ADN/ARN.

19. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la hebra superior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo está compuesta por 24 desoxirribonucleótidos en 5' seguido de un fragmento de 8 ribonucleótidos en 3'.

20. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque la hebra inferior del adaptador bicatenario de extremo cohesivo comprende en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria de 6 bases.

21. Kit para la producción de ADNc de longitud completa, caracterizado porque comprende por lo menos:

- fosfatasa alcalina y su tampón de reacción
- pirofosfatasa ácida del tabaco y su tampón de reacción
- una ligasa, o un cóctel de ligasas, que comprende en particular la T4 ADN ligasa y su tampón de reacción
- un adaptador bicatenario de extremo cohesivo, comprendiendo dicho adaptador bicatenario de extremo cohesivo una hebra superior que contiene un sitio 3'OH aceptor de ligasa para el acoplamiento con el 5' de los ARN, y una hebra inferior que presenta en 5' una extensión oligonucleotídica monocatenaria de secuencia aleatoria que puede aparearse con el extremo 5' de los ARN.
- una transcriptasa inversa
- una ADN polimerasa dependiente de ADN
- unos cebadores oligonucleotídicos para la polimerización del ADN.

 

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