Método para reducir o prevenir sustancialmente la formación de un derivado de trisulfuro de un polipéptido en un medio líquido conteniendo dicho polipéptido,

comprendiendo el método de desorción dicho medio líquido con un gas seleccionado del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno (N2), o los gases nobles, en particular helio (He), (Ar) argón y combinaciones de los mismos

Método para prevenir la formación de derivados de trisulfuro de polipéptidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para prevenir la formación de derivados de trisulfuro de polipéptidos durante la producción o tratamiento del mismo en medios líquidos.

En particular, la invención se refiere a la producción de una hormona del crecimiento humana, o un intermediario, derivado, análogo, variante o mutante de la misma, que está sustancialmente libre de, o contiene una cantidad reducida de, derivado(s) de trisulfuro.

Antecedentes de la invención

Varios polipéptidos conteniendo enlaces de disulfuro se conocen por formar derivados de trisulfuro. Entre estos están superóxido-dismutasa, interleuquina muteina y hormona del crecimiento (GH). En principio, no obstante, otros polipéptidos conteniendo enlaces de disulfuro, p. ej. insulina, interleukinas y determinados factores de coagulación (tales como factor VII) pueden formar de forma potencial derivados de trisulfuro bajo condiciones específicas.

Entre la mayoría de los polipéptidos estudiados conocidos por formar derivados de trisulfuro están las hormonas de crecimiento (GH), en particular la hormona del crecimiento humana. El término "hormona del crecimiento humana" (hGH; a veces también referida, entre otras cosas, como "somatropina" o "somatotropina") se entiende generalmente por referirse a la hormona proteínica (polipéptido) que consiste en una única cadena de 191 residuos de aminoácidos reticulados por dos puentes de disulfuro, teniendo la forma monomérica de la misma un peso molecular de aprox. 22.000 (22 kDa). Las preparaciones de hormonas del crecimiento aisladas de la glándula pituitaria humana no son homogéneas. Por ejemplo, también se conoce una variante más pequeña (20 kDa) producida a partir del mismo gen. La variante "hGH básica" (hGH-V) expresada por la placenta durante el embarazo es otro análogo/variante el cual es un producto de un gen separado; como el polipéptido hGH de 22 kDa éste consiste en 191 residuos de aminoácidos, pero 13 residuos de aminoácidos en diferentes posiciones en la secuencia difieren de los de la hGH de 22 kDa [véase, p. ej, Bewley et al., Adv. Enzymol. 42, 73-166 (1975), y Frankenne et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol. 66, 1171-1180 (1988)].

En la hGH (es decir, el polipéptido de 22 kDa), cuatro residuos de cisteína están presentes proporcionando altura a los dos puentes de disulfuro. El primer puente de disulfuro forma un bucle mayor entre Cys 53 y Cys 165, mientras que el segundo forma un bucle menor entre Cys 182 y Cys 189. El bucle menor se localiza en la superficie de la molécula, mientras que el bucle mayor se introduce en la molécula de hGH. Una formación de puente de trisulfuro puede ocurrir en el bucle menor y en el mayor.

La hormona del crecimiento humana es esencial, entre otras cosas, para el crecimiento del hueso longitudinal y el desarrollo del crecimiento normal durante la infancia. Se conocen otros numerosos efectos o aplicaciones de la hGH, incluyendo la mejora en la curación de fracturas de hueso, la descomposición del tejido adiposo y la minimización del síndrome de fatiga postoperatoria.

La producción de polipéptidos terapéuticamente útiles, p. ej. la hGH, en una escala industrial se realiza en la actualidad habitualmente usando técnicas recombinantes. Algunos de los procesos recombinantes desarrollados usan huéspedes bacterianos, tales como diferentes cepas de Escherichia coli, mientras que otros procesos usan microorganismos eucarióticos, tales como levaduras (p. ej. Saccharomyces cerevisiae), como huéspedes.

Después de la producción (fermentación), el medio comprendiendo el polipéptido recombinante normalmente se sigue procesando. Durante un tratamiento de este tipo el polipéptido puede someterse a diferentes procesos de extracción y purificación, tales como centrifugado, microfiltración y/o ultrafiltración.

Uno de los problemas encontrados usando métodos de fabricación recombinantes convencionales para producir polipéptidos es la formación de subproductos de polipéptidos. En la producción de polipéptidos conteniendo enlaces de disulfuro, la formación de derivados, en particular de derivados de trisulfuro, puede ser problemática.

El derivado del trisulfuro en cuestión es uno donde la molécula peptídica contiene un átomo de azufre extra que forma un "puente de trisulfuro" dentro de la molécula. Tal derivado de trisulfuro se ha aislado durante la producción de la hormona del crecimiento, donde ésta constituye un subproducto indeseable.

Así, WO 94/24157 expone un método para detectar un derivado hidrofóbico de hGH comprendiendo un átomo de azufre extra en comparación con la hGH nativa. El átomo de azufre extra del derivado hidrofóbico de hGH forma un "puente de trisulfuro" produciendo un derivado de trisulfuro de hGH (TS-hGH). También se describe un método para reconvertir este derivado de trisulfuro de la hGH de nuevo a su forma nativa de hGH tratando el derivado de trisulfuro de la hGH con un compuesto de mercapto, tal como cisteína, glutationa, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol.

Además, el derivado de trisulfuro de la hGH se ha descrito por Andersson et al., "Isolation and characterization of a trisulfide variant of recombinant human growth hormone formed during expression in Escherichia coli", ("Aislamiento y caracterización de una variante de trisulfuro de la hormona del crecimiento humana recombinante formada durante la expresión de Escherichia coli") Int. J. PeDtide Protein Res. 47 (1996) págs. 311-321, y por A. Jesperson et al., "Characterisation of a trisulfide derivative of biosintetic human growt hormone produced in Escherichia coli", ("Caracterización de un derivado de trisulfuro de la hormona del crecimiento humana producida en Escherichia coli") Eur J. Biochem. 219 (1994) págs. 365-373 (1994), y derivados de trisulfuro también se han proporcionado para otros péptidos, es decir, superóxido-dismutasa recombinante [Briggs et al., Biochem. Biophys. Acta, 537 (1978) págs. 100-109] y una muteína de interleuquina [J. Bretón et al., J. Chromatoar. A 709 (1) (1995) págs. 135-46].

WO 96/02570 describe otro método para reconvertir el derivado de trisulfuro de la hGH de nuevo a su forma nativa de hGH tratando el derivado con un compuesto de sulfito, tal como sulfito de sodio, sulfito de potasio o sulfito de amonio, o un sulfito de metal alcalinotérreo tal como sulfito de magnesio o sulfito de calcio.

WO 00/02900 describe, entre otras cosas, un método para la producción de péptidos recombinantes con una cantidad baja de trisulfuros, caracterizado por la adición de una sal metálica (p. ej. potasio o sal sódica) durante o después de la etapa de fermentación.

WO 04/31213 expone, entre otras cosas, un método para reducir la cantidad de una impureza de isoforma de trisulfuro producida en la producción recombinante de un "polipéptido de antagonista de la hormona del crecimiento" en células huéspedes genéticamente modificadas, donde la impureza se pone en contacto con un "compuesto de mercapto" (ejemplificado por sulfitos, glutationa, ß-mercapto-etanol, ditiotreitol, cisteína y otros). La solicitud también expone el uso de agentes quelantes o sales metálicas para conseguir una reducción en la cantidad de trisulfuro formado.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la distribución de especies de sulfuro de hidrógeno (H₂S, HS y S²-, respectivamente) en agua a 20ºC como una función del pH.

La Figura 2 muestra mecanismos sugeridos de formación de derivados de trisulfuro de péptidos en presencia de H₂S.

La Figura 3 muestra el impacto de la exposición en la formación de TS-hGH en homogeneizado micro-filtrado, a partir de un cultivo discontinuo produciendo hGH.

Breve descripción de la invención

Se ha descubierto sorprendentemente que la formación de un derivado de trisulfuro de un polipéptido durante la producción y/o el tratamiento del polipéptido en un medio líquido puede minimizarse o evitarse mediante un proceso en el cual el medio líquido se deshace con un gas, p. ej. por aireación del medio mediante el pasaje a través del mismo de una corriente de burbujas del gas en cuestión.

Descripción detallada de la invención

Como se ha indicado anteriormente, un aspecto de la invención se refiere a un método para reducir o prevenir sustancialmente la...

1. Método para reducir o prevenir sustancialmente la formación de un derivado de trisulfuro de un polipéptido en un medio líquido conteniendo dicho polipéptido, comprendiendo el método de desorción dicho medio líquido con un gas seleccionado del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno (N₂), o los gases nobles, en particular helio (He), (Ar) argón y combinaciones de los mismos.

2. Método según la reivindicación 1, donde dicho polipéptido contiene uno o más enlaces de disulfuro.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde dicho polipéptido es un polipéptido producido recombinantemente.

4. Método según la reivindicación 3, donde dicho polipéptido se selecciona de: hGH producida recombinantemente (rhGH); formas truncadas de la misma; sus análogos; y derivados de la misma.

5. Método según la reivindicación 3 ó 4, donde dicha desorción se realiza durante el tratamiento de producción o post-producción de dicho polipéptido.

6. Método según la reivindicación 3 ó 4, donde dicha desorción se realiza durante el tratamiento de post-producción de dicho polipéptido.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho gas se selecciona del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno (N₂), helio (He), argón (Ar) y combinaciones de los mismos y neón (Ne), kriptón (Kr) y xenón (Xe).

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho gas se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno (N₂), helio (He) y argón (Ar).

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho polipéptido se somete a una o más etapas de purificación después del procedimiento de desorción.

10. Método según la reivindicación 9 comprendiendo al menos una etapa de filtración.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-10, donde un sulfito o compuesto de mercapto se añade al medio líquido después de la producción de dicho polipéptido.