Método para purificar anticuerpos.

Método determinativo de la concentración de una sal para eluir en una sola etapa una inmunoglobulina apartir de un material de cromatografía de intercambio catiónico débil,

que comprende las dos siguientes etapas:

a) etapa uno, que comprende las siguientes subetapas

a1) preparar una solución que contenga una inmunoglobulina, una sustancia tampón y opcionalmente una sal;

a2) poner en contacto un primer alícuota de la solución que contiene la inmunoglobulina con un material deintercambio catiónico débil que lleva un grupo carboxílico como sustituyente cargado, en unas condiciones quepermiten la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil;

a3) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio catiónico débil, usando una solución que lleva unasustancia tampón y una sal, cuya concentración se incrementa linealmente;

a4) determinar la concentración inicial de la sal, a la cual la primera fracción de la inmunoglobulina empieza aeluirse de la columna de intercambio catiónico débil;

b) etapa dos, que comprende las siguientes subetapas

b1) poner en contacto un segundo alícuota de la solución que contiene la inmunoglobulina con un material deintercambio catiónico débil que lleva un grupo carboxílico como sustituyente cargado, en unas condiciones quepermiten la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil;

b2) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio catiónico débil, usando un método de elución en tresetapas donde

i) la concentración de sal en la primera etapa de elución se calcula como la suma deel producto de la concentración inicial de la sal determinada en la etapa a4) y el número total de cationesmonovalentes diferentes de hidrógeno indicado en la fórmula molecular de la sal

y

el producto de la concentración de la sal tampón y el número total de cationes monovalentes diferentes dehidrógeno indicado en la fórmula molecular de la sal tampón;

ii) la concentración de sal en la segunda etapa de elución es el producto de la concentración de sal en laprimera etapa de elución y un factor entre 1,25 y 1,35;

iii) la concentración de sal en la tercera etapa de elución es el producto de la concentración de sal en laprimera etapa de elución y un factor entre 1,50 y 1,70;

donde los factores de las etapas ii) y iii) se determinan de la manera siguiente: a una concentración inicial entre10 mM y 40 mM los factores son 1,35 y 1,70 respectivamente; a una concentración inicial entre 40 mM y 70 mMlos factores son 1,30 y 1,60 respectivamente, y a una concentración inicial superior a 70 mM los factores son1,25 y 1,50 respectivamente;

b3) determinar a cuál de las tres subetapas del método de elución de la etapa b2) se eluye la inmunoglobulina dela columna de intercambio catiónico débil y definir así la concentración de una sal para eluir una inmunoglobulinade un material de intercambio catiónico débil en una única etapa de elución.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10175706.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: FALKENSTEIN,Roberto, KOLB,Burkard, SMIDA,Maria.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B01D15/36 TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B01 PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL.B01D SEPARACION (separación de sólidos por vía húmeda B03B, B03D, mesas o cribas neumáticas B03B, por vía seca B07; separación magnética o electrostática de materiales sólidos a partir de materiales sólidos o de fluidos, separación mediante campos eléctricos de alta tensión B03C; aparatos centrifugadores B04B; aparato de vórtice B04C; prensas en sí para exprimir los líquidos de las sustancias que los contienen B30B 9/02). › B01D 15/00 Procedimientos de separación que implican el tratamientos de líquidos con absorbentes sólidos; Aparatos para ello. › implicando la interacción iónica, p.ej. intercambio de iones, supresión de iones o exclusión de iones.
  • C07K16/06 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › del suero.
  • C07K16/28 C07K 16/00 […] › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
  • C07K16/32 C07K 16/00 […] › contra productos de traducción de oncogenes.
  • G01N30/34 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 30/00 Investigación o análisis de materiales por separación en constituyentes utilizando la adsorción, la absorción o fenómenos similares o utilizando el intercambio iónico, p. ej. la cromatografía (G01N 3/00 - G01N 29/00 tienen prioridad). › de la composición del fluido, p. ej. del gradiente (G01N 30/36 tiene prioridad).

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Fragmento de la descripción:

Método para purificar anticuerpos

Ámbito de la presente invención

La presente invención se refiere al campo de la purificación de polipéptidos. Se indica un método para determinar rápidamente las condiciones de purificación.

Antecedentes de la presente invención

Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas juegan un papel importante en el catálogo médico actual. Para el uso humano cualquier sustancia farmacéutica tiene que cumplir distintos criterios. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos en las personas hay que eliminar, sobre todo, ácidos nucleicos, virus y proteínas de la célula huésped capaces de causar daños graves. Para satisfacer la especificación reglamentaria hay que llevar a cabo una o más etapas de purificación después del proceso de elaboración. Entre otros aspectos, la pureza, la productividad y el rendimiento tienen un papel importante en la definición de un proceso apropiado de purificación.

Para la purificación de proteínas hay varios métodos bien establecidos y generalizados, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (p.ej. cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G) , la cromatografía de intercambio iónico (p.ej. de intercambio catiónico (resinas carboximetílicas) , de intercambio aniónico (resinas aminoetílicas) y de intercambio iónico mixto) , la adsorción tiofílica (p.ej. con beta-mercaptoetanol u otros ligandos SH) , la cromatografía de interacción hidrófoba o de adsorción aromática (p.ej. con fenil-sefarosa, con resinas azaarenofílicas o con ácido m-aminofenilborónico) , la cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (p.ej. con material de afinidad de Ni (II) y Cu (II) ) , la cromatografía de exclusión de tamaños y métodos electroforéticos (como la electroforesis de gel, la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .

Necina, R. y otros, Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698, han informado de la captura de anticuerpos monoclonales humanos, directamente de sobrenadantes de cultivos celulares, mediante agentes de intercambio iónico con gran densidad de carga. En la patente WO 89/05157 se revela un método para purificar inmunoglobulinas, sometiendo directamente el medio de cultivo celular a un tratamiento de intercambio catiónico. Danielsson, A., y otros, J. Immun. Meth. 115 (1988) , 79-88, describen una purificación en una sola etapa de anticuerpos IgG a partir de ascitis de ratón.

Raweerith, R. y otros (J. Immun. Meth. 282 (2003) 63-72) han empleado una combinación de métodos, a saber: precipitación con ácido caprílico y cromatografía de intercambio iónico, como recurso para fraccionar el anticuerpo F (ab’) 2 equino antiveneno digerido con pepsina. En la patente WO 2003/102132 se revela la combinación de una etapa de purificación por inafinidad y una filtración de flujo tangencial de gran rendimiento, para purificar proteínas. En la patente WO 92/19973 se divulga la combinación de dos etapas de cromatografía de afinidad.

Follman, D.K. y Fahrner, R.L. han publicado un análisis factorial de procesos de purificación de anticuerpos con el empleo de tres etapas cromatográficas sin proteína A (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85) . Mhatre, R. y otros (J. Chrom. A 707 (1995) 225-231) han investigado la purificación de fragmentos Fab de anticuerpo por cromatografía de intercambio catiónico y elución con gradiente de pH.

La patente WO 94/00561 revela anticuerpos monoclonales humanos anti-rhesus y líneas celulares para producirlos. En la patente WO 2004/024866 se expone un método para purificar un polipéptido por cromatografía de intercambio iónico, en el cual se usa un lavado con gradiente para separar el polipéptido deseado de uno o más contaminantes. Schwarz, A. y otros (Laborpraxis 21 (1997) 62-66) informan de la purificación de anticuerpos monoclonales con una columna CM-HyperD.

La patente WO 2004/076485 revela un proceso para purificar anticuerpos mediante proteína A y cromatografía de intercambio iónico. En la patente EP 0 530 447 se expone un proceso para purificar anticuerpos monoclonales IgG mediante una combinación de tres etapas cromatográficas. La eliminación de proteína A de las preparaciones de anticuerpo se indica en la patente US 4, 983, 722.

La patente WO 95/16037 revela la purificación de anticuerpos monoclonales biespecíficos anti-EGF-R/anti-CD3 de hibridoma híbrido, realizada mediante cromatografía de intercambio catiónico con proteína A. La separación de los anticuerpos monoméricos de sus multímeros, usando cromatografía de intercambio iónico, se expone en la patente EP 1 084 136. La patente US 5, 429, 746 se refiere a la aplicación de la cromatografía de interacción hidrófoba y la cromatografía de combinación para purificar moléculas proteicas de anticuerpo.

Ishihara, T. y otros (J. Chrom. 1069 (2005) 99-106 informan sobre la optimización de la purificación de anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de intercambio iónico.

Resumen de la presente invención

La presente invención proporciona un método determinativo de la concentración de una sal para eluir en una sola etapa una inmunoglobulina a partir de un material de cromatografía de intercambio catiónico débil, que comprende las dos siguientes etapas:

a) etapa uno, que comprende las siguientes subetapas a1) preparar una solución que contenga una inmunoglobulina, una sustancia tampón y opcionalmente una sal; a2) poner en contacto un primer alícuota de la solución que contiene la inmunoglobulina con un material de intercambio catiónico débil que lleva un grupo carboxílico como sustituyente cargado, en unas condiciones que permitan la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio iónico; a3) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio catiónico débil, usando una solución que lleve una sustancia tampón y una sal, cuya concentración se incrementa linealmente; a4) determinar la concentración inicial de la sal, a la cual la primera fracción de la inmunoglobulina empieza a eluirse de la columna de intercambio catiónico débil; b) etapa dos, que comprende las siguientes subetapas b1) poner en contacto un segundo alícuota de la solución que contiene la inmunoglobulina con un material de intercambio catiónico débil que lleva un grupo carboxílico como sustituyente cargado, en unas condiciones que permitan la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil; b2) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio catiónico débil, usando un método de elución en tres etapas donde

i) la concentración de sal en la primera etapa de elución se calcula como la suma de el producto de la concentración inicial de la sal determinada en la etapa a4) y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno indicado en la fórmula molecular de la sal y el producto de la concentración de la sal tampón y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno indicado en la fórmula molecular de la sal; ii) la concentración de sal en la segunda etapa de elución es el producto de la concentración de sal en la primera etapa de elución y un factor entre 1, 25 y 1, 35; iii) la concentración de sal en la tercera etapa de elución es el producto de la concentración de sal en la primera etapa de elución y un factor entre 1, 50 y 1, 70;

donde los factores de las etapas ii) y iii) se determinan de la manera siguiente: a una concentración inicial entre 10 mM y 40 mM los factores son 1, 35 y 1, 70 respectivamente; a una concentración inicial entre 40 mM y 70 mM los factores son 1, 30 y 1, 60 respectivamente, y a una concentración inicial superior a 70 mM los factores son 1, 25 y 1, 50 respectivamente; b3) determinar a cuál de las tres subetapas del método de elución de la etapa b2) se eluye la inmunoglobulina de la columna de intercambio catiónico débil y definir así la concentración de una sal para eluir una inmunoglobulina de un material de intercambio catiónico débil en una única etapa de elución.

Descripción detallada de la presente invención

En esta solicitud de patente se usan estos términos conforme a la siguiente definición: Tal como se usa en esta solicitud de patente, el término “resina de intercambio iónico” o “material de intercambio iónico” significa una matriz inmóvil de alto peso molecular que lleva sustituyentes cargados, unidos por enlace covalente. Para que la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método determinativo de la concentración de una sal para eluir en una sola etapa una inmunoglobulina a

partir de un material de cromatografía de intercambio catiónico débil, que comprende las dos siguientes etapas: a) etapa uno, que comprende las siguientes subetapas a1) preparar una solución que contenga una inmunoglobulina, una sustancia tampón y opcionalmente una sal; a2) poner en contacto un primer alícuota de la solución que contiene la inmunoglobulina con un material de intercambio catiónico débil que lleva un grupo carboxílico como sustituyente cargado, en unas condiciones que permiten la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil; a3) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio catiónico débil, usando una solución que lleva una sustancia tampón y una sal, cuya concentración se incrementa linealmente; a4) determinar la concentración inicial de la sal, a la cual la primera fracción de la inmunoglobulina empieza a eluirse de la columna de intercambio catiónico débil; b) etapa dos, que comprende las siguientes subetapas b1) poner en contacto un segundo alícuota de la solución que contiene la inmunoglobulina con un material de intercambio catiónico débil que lleva un grupo carboxílico como sustituyente cargado, en unas condiciones que permiten la fijación de la inmunoglobulina al material de intercambio catiónico débil; b2) recuperar la inmunoglobulina del material de intercambio catiónico débil, usando un método de elución en tres etapas donde

i) la concentración de sal en la primera etapa de elución se calcula como la suma de el producto de la concentración inicial de la sal determinada en la etapa a4) y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno indicado en la fórmula molecular de la sal y el producto de la concentración de la sal tampón y el número total de cationes monovalentes diferentes de hidrógeno indicado en la fórmula molecular de la sal tampón; ii) la concentración de sal en la segunda etapa de elución es el producto de la concentración de sal en la primera etapa de elución y un factor entre 1, 25 y 1, 35; iii) la concentración de sal en la tercera etapa de elución es el producto de la concentración de sal en la primera etapa de elución y un factor entre 1, 50 y 1, 70;

donde los factores de las etapas ii) y iii) se determinan de la manera siguiente: a una concentración inicial entre 10 mM y 40 mM los factores son 1, 35 y 1, 70 respectivamente; a una concentración inicial entre 40 mM y 70 mM los factores son 1, 30 y 1, 60 respectivamente, y a una concentración inicial superior a 70 mM los factores son 1, 25 y 1, 50 respectivamente; b3) determinar a cuál de las tres subetapas del método de elución de la etapa b2) se eluye la inmunoglobulina de la columna de intercambio catiónico débil y definir así la concentración de una sal para eluir una inmunoglobulina de un material de intercambio catiónico débil en una única etapa de elución.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunoglobulina es un miembro de la clase de las inmunoglobulinas G o E.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustancia tampón es ácido cítrico o una sal del mismo o ácido fosfórico o una sal del mismo.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un método cromatográfico

o por lotes.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sal se elige del grupo formado por cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, sales de ácido cítrico, sales de ácido fosfórico y mezclas de estos componentes.


 

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