Método para producir proteínas gamma-carboxiladas.

Una célula hospedadora CHO-S que comprende ácido nucleico que codifica una protrombina humana recombinante (factor de coagulación II) y una g-glutamil carboxilasa recombinante,

en la que la célula hospedadora comprende un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV) para el control de la expresión de protrombina humana recombinante y un promotor temprano de SV40 para el control de la expresión para la g- glutamil carboxilasa recombinante.

Método para producir proteínas gamma-carboxiladas Campo técnico

La presente invención se refiere una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gamma-carboxilación y secuencias de control de la expresión asociadas que comprenden un primer promotor y una molécula de ácido nucleico que codifica una y- glutamil carboxilasa y secuencias de control de la expresión asociadas que comprenden un segundo promotor. La invención se refiere adicionalmente a un método para producir una proteína que requiere gamma-carboxilación en altos rendimientos.

Antecedentes de la invención

La hemorragia es un problema clínico común. Es una consecuencia de enfermedad, traumatismo, cirugía y tratamiento medicinal. Es imperativo detener mecánicamente las hemorragias. Esto puede ser difícil o incluso imposible debido a la ubicación de la hemorragia o porque se difunde desde muchos vasos (pequeños). Los pacientes que están sangrando por tanto pueden requerir tratamiento con agentes que mantienen la hemostasis. Éste puede ser productos derivados de la sangre (hemoterapia), agentes que causan la liberación de agentes hemostáticos endógenos, factores de coagulación recombinantes (F), o agentes que retardan la disolución de los coágulos de sangre.

El tratamiento de primera línea entre los productos derivados de la sangre, a menudo obtenidos del hospital local, son sangre completa para la sustitución del volumen y el mantenimiento de la hemostasis, glóbulos rojos concentrados para la mejora de la capacidad de transporte de oxígeno, concentrados de plaquetas para aumentar el número de plaquetas (si es bajo o deficiente) y plasma fresco congelado para el mantenimiento de la hemostasis (coagulación de la sangre y agregación plaquetaria). Los productos derivados de plasma de segunda que mantienen la hemostasis son crioprecipitado de plasma, concentrados de complejo de protrombina, concentrados de complejo de protrombina activado y factores de coagulación purificados. Varios factores de coagulación están hoy disponibles como proteínas humanas recombinantes, inactivos (factores de coagulación VIII y IX) y activados (factor de coagulación VIla).

La hemofilia es un trastorno hemorrágico hereditario o adquirido con factor de coagulación anormal o deficiente o anticuerpos dirigidos contra un factor de coagulación que inhibe la función procoagulante. Las hemofilias más comunes son la hemofilia A (ausencia de factor de coagulación VIII) y la hemofilia B (factor IX). Los factores de coagulación individuales purificados o recombinantes son el principal tratamiento de los pacientes con hemofilia. Los pacientes con anticuerpos inhibidores poseen un problema de tratamiento, ya que también pueden neutralizar el factor de coagulación que se administra al paciente. La forma activa de la proteína C (APC) es un inhibidor de la coagulación plasmática mediante degradación de los factores de coagulación activado Va y Villa. Se ha demostrado que APC recombinante es un tratamiento eficaz de la coagulación plasmática indebida en pacientes con sepsis.

Los factores de coagulación para uso terapéutico se pueden obtener a partir de plasma humano, aunque el proceso de purificación no es simple y requiere muchas etapas de las cuales varias están dirigidas a eliminar virus contaminantes. Pero incluso con medidas de seguridad extensivas y ensayos de productos derivados de la sangre, la contaminación con virus o priones infecciosos no puede descartarse. Debido a este riesgo es muy deseable producir proteínas terapéuticas humanas a partir de células recombinantes cultivadas en medios sin componentes derivados de animales. Esto no siempre es sencillo ya que muchas proteínas requieren un hospedador mamífero que las produzca en una forma totalmente funcional, es decir, las modifique correctamente después de la traducción. Entre los factores de coagulación producidos comercialmente en células recombinantes están FVII (NovoSeven), FVIII (Kogenate, Recombinate, Refacto) y FIX(Benefix) (Roddiey Ludlam. Blood Rev. 11: 169-177, 1997) y proteína C activa (Xigris). Uno de los principales obstáculos en la obtención de grandes cantidades de factores de coagulación humanos recombinantes totalmente funcionales radica en el dominio Gla presente en FII, FVII, FIX, FX y Proteína C. Este dominio contiene restos de ácido glutámico que se modifican después de la traducción mediante la adición de grupos carboxilo. La producción de estos factores se ve impedida por el hecho de que la sobreexpresión de los mismos produce proteína sub-carboxilada, y por tanto inactiva. Las modificaciones Gla son el resultado de la acción de una enzima dependiente de vitamina K llamada y-glutamil carboxilasa (GGCX). Esta enzima se ha estudiado ampliamente por muchos científicos, particularmente aquellos implicados en la investigación de factores de coagulación (documento WO-A-8803926; Wu et al. Science 254 (5038): 1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Nati Acad Sci USA 90: 4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274 (24): 16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445: 256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46): 36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276 (11): 7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Nati Acad Sci USA 99 (3): 1264-1269, 2002; Czerwiec et al, Eur J Biochem 269: 6162-6172, 2002; Hallgren et al, Biochemistry 41 (50): 15045-15055, 2002; Harvey et al, The Journal of Biological Chemistry 278 (10): 8363-8369, 2.003). Al menos dos grupos de científicos probaron intentos por aumentar los rendimientos mediante co-expresión de GGCX con factor de coagulación FIX, pero no tuvieron éxito (Rehemtulla, et al. 1993, ibid; Hallgren et al. 2002,

ibid). Considerando el gran interés en las proteínas y-carboxiladas, se puede suponer que muchos más ensayos de co-expresión han fallado y por tanto no se han presentado.

Para FII humano (protrombina) al menos 8 de los 10 restos Glu tienen que modificarse correctamente para obtener protrombina totalmente funcional (Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260: 279-287, 1985; Seegers y Walz 'Prothrombin and other vitamin K proteins', CRC Press, 1986). Se han hecho grandes esfuerzos para obtener altos niveles de producción de rhFII usando varios sistemas diferentes, tales como células CHO, células BHK, células 293 y sistemas de expresión de virus vaccinia, pero han fallado o ha producido un producto de sub-carboxilado y por tanto protrombina funcionalmente inactiva ( J0rgensen et al., J. Biol. Chem. 262: 6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14 (2): 222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38 (2): 129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8 (3): 358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10: 214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid; Wu y Suttie Thromb Res 96 (2): 91-98, 1999). Las productividades presentadas anteriormente para protrombina humana recombinante carboxilada son bajas; 20 mg/l para protrombina muíante (Cote et al., J. Biol. Chem 269: 11374- 11380, 1994), 0,55 mg/l para protrombina humana expresada en células CHO (completamente carboxilada, Jorgensen et al. 1987, ibid), 25 mg/l en células CHO (grado de carboxilación no mostrado, Russo et. al., 1997, ibid).

El documento WO 92/19636 describe la clonación e identificación de secuencia de una carboxilasa dependiente vitamina K humana y bovina. La solicitud sugiere la co-expresión de la carboxilasa dependiente de vitamina K y una proteína dependiente de vitamina K en una célula hospedadora adecuada para preparar la proteína dependiente de vitamina K. No se ejemplifica co-expresión de la carboxilasa y proteína dependiente de la vitamina K.

El documento WO 02/29045 A2 describe un método para preparar proteínas dependientes de vitamina K y células hospedadoras eucariotas co-transfectadas, y vectores recombinantes, a usar en métodos para preparar proteínas dependientes de vitamina K.

Existe la necesidad de métodos mejorados para producir factores de coagulación sanguínea activados en altos rendimientos. La presente invención propone abordar esta necesidad.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedadora CHO-S de acuerdo con la reivindicación 1 de este documento.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir protrombina humana recombinante activa (factor de coagulación II) de acuerdo con la reivindicación 5 de este documento.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1a ilustra un mapa plasmídico del vector de co-expresión PN32 (protrombina + GGCX).

La Figura 1b representa un mapa plasmídico... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora CHO-S que comprende ácido nucleico que codifica una protrombina humana recombinante (factor de coagulación II) y una y-glutamil carboxilasa recombinante, en la que la célula hospedadora

comprende un promotor temprano inmediato de citomegalovlrus humano (hCMV) para el control de la expresión de protrombina humana recombinante y un promotor temprano de SV40 para el control de la expresión para la y- glutamil carboxilasa recombinante.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en la que dicha protrombina humana recombinante (factor de 10 coagulación II) y dicha y-glutamil carboxilasa recombinante están codificadas en un vector de expresión diferente.

3. La célula hospedadora de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el vector de expresión comprende ácido nucleico que codifica tanto la protrombina humana recombinante (factor de coagulación II) como la y-glutamil carboxilasa recombinante.

4. La célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha y-glutamil carboxilasa recombinante es una y-glutamil carboxilasa humana.

5. Un método para producir una protrombina humana recombinante activa (factor de coagulación II) que comprende:

(i) cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y (¡I) aislar la protrombina humana

recombinante activa (factor de coagulación II).