Método para generar mosaicos de genes.

Un método para generar un mosaico de genes mediante recombinación somática in vivo de secuencias deADN homeólogas,

que comprende

a) en un procedimiento de una sola etapa,

(i) transformar 5 una célula que carece de reparación de ADN con al menos un gen A que tiene unahomología de secuencia de al menos 30% y menos de 99,5% con otro gen que se va a recombinar quees una parte integral del genoma celular o está presente en el armazón de una estructura artificialgenética, empleando al menos un gen B que se va a recombinar,

(ii) recombinar dichos genes,

(iii) generar un mosaico génico de los genes en un sitio de integración de un genoma diana,en donde dicho al menos un gen A tiene una única secuencia diana flanqueante en el extremo 5' o elextremo 3' que se ancla al extremo 5' o al extremo 3' de dicho sitio de integración, en donde lasecuencia diana flanqueante única del gen A está anclada al extremo 5' del sitio de integraciónmientras que el gen B tiene una secuencia diana flanqueante única que se ancla al extremo 3', y

b) seleccionar los clones que comprenden al menos un mosaico de genes intragénico.

Método para generar mosaicos de genes La invención se refiere a métodos para generar mosaicos de genes mediante recombinación homeóloga in vivo.

Antecedentes Uno de los principales objetivos del diseño de proteínas es generar proteínas con nuevas propiedades o mejoradas. La capacidad para conferir una actividad deseada a una proteína o enzima tiene una aplicación práctica considerable en la industria química y farmacéutica. La evolución dirigida de proteínas ha emergido como una plataforma tecnológica de gran alcance en la ingeniería de proteínas, en donde en genotecas de variantes se buscan experimentalmente clones que poseen las propiedades deseadas.

La evolución dirigida de proteínas aprovecha el poder de la selección natural para evolucionar proteínas o ácidos nucleicos con propiedades deseables que no se encuentran en la naturaleza. Se utilizan diversas técnicas para la generación de proteínas mutantes y variantes, y la selección de funciones deseables. Tecnologías de ADN recombinante han permitido la transferencia de genes estructurales individuales o de genes para una ruta completa, a un hospedador representativo adecuado para una propagación rápida y/o una producción superior de proteínas.

Mejoras acumuladas en la actividad o de otras propiedades se obtienen generalmente a través de repeticiones de mutaciones y selección. Las aplicaciones de la evolución dirigida se destinan principalmente a laboratorios experimentales e industriales, para mejorar la estabilidad proteica y mejorar la actividad o el rendimiento general de enzimas y organismos, o para alterar la especificidad de un sustrato enzimático y para diseñar nuevas actividades. La mayoría de los proyectos de evolución dirigida buscan evolucionar propiedades que son útiles para los seres humanos en un contexto agrícola, médico o industrial (biocatálisis) .

La evolución de rutas metabólicas completas es un concepto particularmente atractivo, porque la mayoría de los compuestos naturales y novedosos son producidos por rutas en lugar de por enzimas individuales. La modificación genética de rutas metabólicas por lo general requiere la manipulación coordinada de todas las enzimas de la ruta. La evolución de nuevas rutas metabólicas y la mejora del bioprocesamiento normalmente se realiza a través de un procedimiento de ciclos repetitivos de recombinación y escrutinio o selección para evolucionar genes individuales, plásmidos enteros, agrupamientos multigénicos o incluso genomas enteros.

Shao et al. (Nucleic Acids Research 37 (2) :e16 Epub 12 de diciembre 2008) describen el ensamblaje de ADN recombinante largo que codifica una ruta bioquímica completa o un genoma en una sola etapa a través de la recombinación homóloga in vivo de dos regiones flanqueantes (anclaje) en los extremos 5’ y 3’ que contienen secuencias del extremo 5’ o 3’ del fragmento adyacente en Saccharomyces cerevisiae.

Elefanty et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 11897-11902 (1998) ) describen experimentos de direccionamiento de genes para generar ratones mutantes, en donde el gen informador lacZ se ha inactivado en el locus SCL. Se hace referencia a la Fig. 1 que muestra la estrategia de direccionamiento de genes para SCL-lacZ empleando dos secuencias de anclaje, es decir, una en cada uno de los extremos 5’ y 3’.

La evolución dirigida se puede realizar en células vivas, también llamada evolución in vivo, o puede no implicar células en absoluto (evolución in vitro) . La evolución in vivo tiene la ventaja de seleccionar características en un entorno celular, que es útil cuando la proteína o el ácido nucleico evolucionado se va a utilizar en organismos vivos. La recombinación homóloga in vivo en levadura ha sido ampliamente utilizada para la clonación de genes, la construcción de plásmidos y la creación de genotecas.

La diversidad de una genoteca se obtiene a través de mutagénesis o recombinación. La transposición de ADN permite la recombinación directa de mutaciones beneficiosas procedentes de múltiples genes. En la transposición de ADN, una población de secuencias de ADN se fragmentan al azar y a continuación se vuelven a ensamblar en secuencias híbridas de longitud completa.

A los efectos de la recombinación homóloga, se utilizan genes homólogos presentes en la naturaleza como fuente 45 para iniciar la diversidad. Los miembros de una genoteca de transposición de un solo gen son idénticos típicamente en más del 95%. La transposición de familias, sin embargo, permite el intercambio en bloque de secuencias que son idénticas típicamente en más del 60%. La diversidad funcional de la secuencia proviene de secuencias parentales relacionadas que han sobrevivido a la selección natural; por lo tanto, se tolera un número mucho mayor de mutaciones en una secuencia dada, que no introducen efectos perjudiciales en la estructura o la función.

La recombinación de fragmentos de ADN de origen diferente, con hasta un 30% de diversidad se describe en el documento WO1990007576A1. Se producen genes híbridos in vivo mediante recombinación intergenérica y/o interespecífica en bacterias que carecen de reparación de apareamientos erróneos o en bacterias en las que el sistema de reparación de apareamientos erróneos (MMR) está inactivado transitoriamente. De esta manera se evitan los procesos a través de los cuales se repara el ADN dañado, lo que tendría un efecto inhibidor sobre la 55 frecuencia de la recombinación entre secuencias divergentes, es decir, la recombinación homeóloga.

Una revisión de los mecanismos básicos de la MMR es proporcionada por Kunz et al. (Cell. Mol. Life Sci. 66 (2009) 1021-1038) ) .

Una recombinación homeóloga dirigida se describe en plantas carentes de MMR (documento WO2006/134496A2) . El direccionamiento a un locus con secuencias que tienen hasta 10% de diferencias era posible.

La recombinación homóloga en bacterias para la generación de genotecas de polinucleótidos se describe en el documento WO03/095658A1. Se generó una genoteca de expresión de polinucleótidos, en la que cada polinucleótido se integra mediante recombinación homóloga en el genoma de una célula hospedadora bacteriana competente, usando un casete de integración lineal no replicante que comprende el polinucleótido y dos secuencias flanqueantes homólogas a una región del genoma de la célula hospedadora.

La diversidad de las genotecas se puede mejorar aprovechando la capacidad de las células haploides para aparearse de manera eficaz, lo que lleva a la formación de un organismo diploide. En su ciclo de vida vegetativa las células de S. cerevisiae tienen un genoma haploide, es decir, cada cromosoma está presente como una sola copia. En ciertas condiciones, las células haploides pueden aparearse. De esta manera se forma una célula diploide. Las células diploides pueden formar células haploides de nuevo, especialmente cuando faltan ciertos nutrientes. A continuación, se someten a un proceso llamado meiosis seguido de esporulación, para formar cuatro esporas haploides. Durante la meiosis los diferentes cromosomas de los dos genomas parentales, se recombinan. Durante la recombinación meiótica, se intercambian fragmentos de ADN dando como resultado un material de ADN recombinado.

El documento WO2005/075654A1 da a conocer un sistema para generar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, que se basa en el ciclo reproductivo sexual de S. cerevisiae. Células diploides heterocigotas se cultivan en condiciones que inducen los procesos de meiosis y formación de esporas. La meiosis se caracteriza generalmente por frecuencias elevadas de recombinación genética. Por lo tanto, los productos de la meiosis, que son células haploides o esporas, pueden contener secuencias de ADN recombinante debido a la recombinación entre las dos secuencias de ADN divergente. A través de un método iterativo, se selecciona la progenie haploide recombinante y se aparea entre sí, los diploides resultantes esporulan de nuevo, y las esporas de su progenie se someten a unas condiciones de selección apropiadas para identificar nuevos eventos de recombinación. Este proceso se describe en células de S. cerevisiae de tipo silvestre o que carecen de una reparación de los apareamientos erróneos. Por lo tanto, los genes de interés, en donde cada uno está flanqueado por dos marcadores de selección, se integran en un locus idéntico en cada uno de los dos cromosomas hermanos de cepas diploides que carecen de una reparación de los apareamientos erróneos. Las secuencias de ADN se añaden al extremo 5’ o 3’ del nuevo fragmento de ADN y son 100% idénticas a las secuencias de ADN flanqueantes del locus en el que el ADN se va a... [Seguir leyendo]

1. Un método para generar un mosaico de genes mediante recombinación somática in vivo de secuencias de ADN homeólogas, que comprende a) en un procedimiento de una sola etapa,

(i) transformar una célula que carece de reparación de ADN con al menos un gen A que tiene una homología de secuencia de al menos 30% y menos de 99, 5% con otro gen que se va a recombinar que es una parte integral del genoma celular o está presente en el armazón de una estructura artificial genética, empleando al menos un gen B que se va a recombinar,

(ii) recombinar dichos genes,

(iii) generar un mosaico génico de los genes en un sitio de integración de un genoma diana,

en donde dicho al menos un gen A tiene una única secuencia diana flanqueante en el extremo 5’ o el extremo 3’ que se ancla al extremo 5’ o al extremo 3’ de dicho sitio de integración, en donde la secuencia diana flanqueante única del gen A está anclada al extremo 5’ del sitio de integración mientras que el gen B tiene una secuencia diana flanqueante única que se ancla al extremo 3’, y

b) seleccionar los clones que comprenden al menos un mosaico de genes intragénico.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que un marcador de selección se utiliza en el mosaico de genes y los clones se seleccionan según la presencia del marcador de selección.

3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en el que se obtienen mosaicos de genes de una secuencia no codificadora, un gen o genes parciales con al menos 3 hasta 20.000 pares de bases

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula se cotransforma con al menos dos variantes diferentes del gen A que se va a recombinar, que son los genes A1 y A2, y opcionalmente con al menos dos variantes diferentes del gen B que se va a recombinar, que son los genes B1 y B2.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos un gen C adicional se cotransforma, el cual tiene una secuencia que se hibrida con una secuencia del gen A y/o dicho otro gen para obtener el ensamblaje de dicho gen C adicional con el gen A y/o dicho otro gen, en donde uno o varios de los genes ensamblados tiene un mosaico de genes intragénico.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho gen A y/o dicho otro gen son secuencias no codificadoras o que codifican un polipéptido o parte de un polipéptido que tiene una actividad.

7. Un método según la reivindicación 5 o 6, en el que múltiples genes que codifican polipéptidos de una ruta bioquímica se recombinan y se ensamblan.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la célula es una célula con una inactivación de un gen de reparación del ADN o una célula que carece de reparación de apareamientos erróneos.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula es una célula eucariota, preferiblemente una célula fúngica, de mamífero o vegetal, o una célula procariota.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que la célula es una célula fúngica, preferiblemente seleccionada a partir del grupo que consiste en Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccaromyces, Yarrowia, Pichia y Aspergillus.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se utiliza un marcador de selección, que se selecciona a partir del grupo que consiste en marcadores nutricionales auxotróficos, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores fluorescentes, marcadores de transgénesis dirigida, marcadores de dominios activadores/de unión y marcadores dominantes recesivos y marcadores colorimétricos.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dichos genes están comprendidos en un polinucleótido lineal, un vector o un cromosoma artificial de levadura.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichos genes son polinucleótidos lineales, preferiblemente de 300 a 20.000 pb.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los genes son secuencias no codificadoras o variantes que codifican un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en enzimas, anticuerpos o partes de los mismos, citocinas, factores de crecimiento, antígenos de vacunas y péptidos.