Método para el pronóstico del ictus.

La presente invención se refiere a un método para pronosticar la evolución funcional en un paciente de ictus que comprende determinar el polimorfismo Arg72Pro del gen Tp53 en una muestra biológica de dicho paciente,

donde la presencia del genotipo Arg/Arg se asocia a mal pronóstico funcional del ictus y la presencia del genotipo Pro/Arg o del genotipo Pro/Pro es indicativo de buen pronóstico funcional de ictus.

Método para el pronóstico del ictus.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en general dentro del campo de la biomedicina y en particular se refiere a un método para pronosticar la evolución funcional de un paciente de ictus.

Antecedentes de la invención

El ictus se define como el trastorno brusco del flujo sanguíneo cerebral que se produce como consecuencia de la oclusión (ictus isquémico o infarto cerebral) o rotura (ictus hemorrágico o hemorragia intracerebral) de vasos sanguíneos cerebrales.

El ictus es la principal causa neurológica de muerte y discapacidad en el adulto en países desarrollados (Rosamond et al. 2008). Durante las últimas décadas, numerosos grupos de investigación han tratado de establecer métodos eficaces de evaluación temprana y aguda de pronóstico tras el accidente cerebrovascular. Actualmente, los factores pronósticos de recuperación funcional en pacientes de ictus se basan, fundamentalmente, en la combinación de factores clínicos y de imagen (Baird et al. A three-item scale for the early prediction of stroke recovery. Lancet 357, 2095-2099. 2001; Muir et al. Imaging of acute stroke. Lancet Neurol 5, 755-768, 2006). Sin embargo, es frecuente que se desconozca, con exactitud, la progresión del estado funcional de dichos pacientes. Es más, pacientes con sintomatología clínica e imagen similares, a menudo responden de manera muy diferente al accidente cerebrovascular, mejorando o empeorando dramáticamente a los pocos días tras el mismo (Davalos et al. Deteriorating ischemic stroke: risk factors and prognosis. Neurology 40, 1865-1869. 1990; Baird and Donnan. Prognostic valué of reperfusion during first 48 hours of ischaemic stroke. Lancet 342, 236.1993; Baird et al. Changes in cerebral tissue perfusión during the first 48 hours of ischaemic stroke: relation to clinical outcome. 1996 J Neurol Neurosurg Psychiatry 61, 26-29.).

El ictus isquémico presenta una mayor prevalencia que el ictus hemorrágico, representando, aproximadamente, el 87% de todos los casos. En ambos casos, se interrumpe el aporte de glucosa y de oxígeno a la región cerebral afectada, lo que desencadena una compleja cascada de señalización celular, denominada "cascada isquémica", que incluye excitotoxicidad, estrés oxidativo y nitrosativo, inflamación, desequilibrio iónico, entre otros, todo ello culmina en la muerte neuronal (Dirnagl U. et al. (1999) Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 22, 391-397; Doyle K. P. et al. (2008) Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology 55, 310-318). Esta interrupción transitoria o permanente del flujo sanguíneo cerebral en un territorio vascular determinado genera un área isquémica que presenta una zona central infartada en la que se produce la muerte celular rápida, predominantemente por necrosis (Lipton P. (1999) Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev 79, 1431-1568). Alrededor de dicha zona se sitúa la denominada "área de penumbra isquémica", cuya vascularización depende de vasos colaterales. En esta zona, la muerte neuronal es más tardía y se produce fundamentalmente por apoptosis (Charriaut-Marlangue et al. 1996. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia: an in situ DNA fragmentation analysis. J Cereb Blood Flow Metab 16, 186-194.; Graham and Chen 2001, Programmed cell death in cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 21, 99-109). Sin embargo, recientemente se ha sugerido que en la zona isquémica se produce inicialmente la muerte por apoptosis, mientras que la necrosis es el resultado del fallo energético que se produce como consecuencia del alto requerimiento de energía del proceso apoptótico (Benchoua et al. 2001. Specific caspase pathways are activated in the two stages of cerebral infarction. J Neurosci 21, 7127-7134).

Actualmente, las estrategias terapéuticas están encaminadas a reducir el daño isquémico y rescatar las células potencialmente viables, inmediatamente tras el ictus. Así, la zona de penumbra, aunque inactiva funcionalmente, es potencialmente recuperable si se normaliza rápidamente el flujo sanguíneo regional y se establecen medidas citoprotectoras que eviten la muerte por apoptosis de las células potencialmente viables (Benchoua et al. 2001. Specific caspase pathways are activated in the two stages of cerebral infarction. J Neurosci 21, 7127-7134; Bandera et al. 2006 Cerebral blood flow threshold of ischemic penumbra and infarct core in acute ischemic stroke: a systematic review. Stroke 37, 1334-1339).

La secuencia de acontecimientos que desencadena la muerte neuronal isquémica no se conoce en su totalidad. En los últimos años se ha descrito que la proteína supresora de tumores p53 está implicada en la muerte neuronal causada por la isquemia cerebral. De hecho, modelos experimentales de isquemia cerebral in vivo han demostrado que p53 se acumula en las áreas lesionadas y funciona como un importante factor pro-apoptótico (Crumrine et al. 1994. Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice. J Cereb Blood Flow Metab 14, 887-891; Li et al, 1994. p53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke 25, 849-855; discussion 855-846; Saito et al. 2005, Modulation of p53 degradation via MDM2-mediated ubiquitylation and the ubiquitin-proteasome system during reperfusion after stroke: role of oxidative stress. J Cereb Blood Flow Metab 25, 267-280; Endo et al. 2006, Mitochondrial translocation of p53 mediates release of cytochrome c and hippocampal CA1 neuronal death after transient global cerebral ischemia in rats. J Neurosci 26, 7974-7983; Luo et al. 2009, Delayed treatment with a p53 inhibitor enhances recovery in stroke brain. Ann Neurol 65, 520-530; Niizuma et al. 2009. Potential role of PUMA in delayed death of hippocampal CA1 neurons after transient global cerebral ischemia. Stroke 40, 618-625).

La proteína p53, codificada por el gen supresor tumoral Tp53, es un factor de transcripción que regula importantes procesos celulares como son: el ciclo celular, la estabilidad génica y la muerte celular por apoptosis. Por ello, los niveles intracelulares de p53 están finamente regulados, ya que de ello va a depender su actividad funcional. Así, p53 tiene una vida media muy corta (15-20 minutos) y se expresa constitutivamente en niveles casi indetectables en la mayoría de células, incluidas las neuronas (Soussi 2000, The p53 tumor suppressor gene: from molecular biology to clinical investigation. Ann NYAcad Sci 910, 121-137; discussion 137-129).

Entre estas condiciones de estrés celular están el estrés genotóxico, la hipoxia/isquemia y la activación oncogénica, lo que desemboca en la estabilización y activación de p53 y, por tanto, la parada del ciclo celular, senescencia y/o apoptosis, dependiendo del contexto celular (Jin and Levine 2001 The p53 functional circuit. J Cell Sci 114, 4139-4140.; Culmsee and Mattson 2005, p53 in neuronal apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 331, 761-777). En el caso de la isquemia cerebral, p53 se acumula y activa rápidamente lo que induce la apoptosis neuronal, tanto en la región isquémica como en la zona de penumbra (Crumrine et al. 1994, Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice. J Cereb Blood Flow Metab 14, 887-891; Li et al. 1994, p53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke 25, 849-855; discussion 855-846; Saito et al. 2005, Modulation of p53 degradation via MDM2-mediated ubiquitylation and the ubiquitin-proteasome system during reperfusion after stroke: role of oxidative stress. J Cereb Blood Flow Metab 25, 267-280; Luo et al. 2009. Delayed treatment with a p53 inhibitor enhances recovery in stroke brain. Ann Neurol 65, 520-530.).

Dentro de la proteína p53 se ha identificado un dominio rico en prolina que es esencial para la función apoptótica de la proteína (Walker K. K. and Levine A. J. (1996) Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression. Proc Nati Acad Sci U S A 93, 15335-15340; Sakamuro et al. (1997). The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest. Oncogene 15, 887-898; Murphy M. E. (2006) Polymorphic variants in the p53 pathway. Cell Death Differ 13, 916-920). Esta región contiene un sitio polimórfico, específico de humanos, situado en el exón 4, codón 72 del gen Tp53 (polimorfismo Arg72Pro)....

1. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus que comprende determinar el polimorfismo Arg72Pro del gen Tp53 en una muestra biológica aislada de un paciente, donde la presencia del genotipo Arg/Arg se asocia a mal pronóstico funcional del ictus y la presencia del genotipo Pro/Arg o del genotipo Pro/Pro es indicativo de buen pronóstico funcional de ictus.

2. Método para pronosticar la evolución funciona de ictus según la reivindicación 1, donde el genotipo Arg/Arg es indicativo de una mayor apoptosis neuronal que el genotipo Pro/Arg o el genotipo Pro/Pro.

3. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ictus es ictus hemorrágico.

4. Método para pronosticar la evolución funcional según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el ictus es ictus isquémico.

5. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la determinación del polimorfismo se realiza mediante el genotipado del exon 4, codón 72 del gen Tp 53.

6. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la determinación del polimorfismo se realiza mediante amplificación del ADN mediante la técnica PCR y posterior análisis por polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).

7. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la determinación del polimorfismo se realiza mediante la secuenciación del exon 4, codón 72 del gen Tp 53.

8. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la muestra es un tejido.

9. Método para pronosticar la evolución funcional de ictus según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la muestra es un fluido.