Método y ocmposición para alterar una patología mediada por células B.

Uso de una primera proteína quimérica y una segunda proteína quimérica para la fabricación de una composición para terapia de un linfoma de células B en un paciente humano,

en el que dicha primera proteína quimérica comprende al menos una parte de una región VH y al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina IgM; y

en el que dicha segunda proteína quimérica comprende al menos una parte de una región VL y al menos una parte de una segunda región constante de inmunoglobulina;

en el que dicha fabricación comprende producir dichas proteínas quiméricas por un método que comprende:

(a) aislar un gen que codifica dicha parte de dicha región VH a partir de células B asociadas con dicho linfoma de células B del paciente;

(b) insertar dicho gen que codifica dicha parte de dicha región VH y un gen que codifica dicha parte de dicha región constante de inmunoglobulina IgM en un vector de expresión para permitir la expresión de dicha primera proteína quimérica;

(c) aislar un gen que codifica dicha parte de dicha región VL a partir de células B asociadas con dicho linfoma de células B del paciente;

(d) insertar dicho gen que codifica dicha parte de dicha región VL y un gen que codifica dicha parte de dicha segunda región constante de inmunoglobulina en un vector de expresión para permitir la expresión de dicha segunda proteína quimérica; y

(e) producir dichas proteínas quiméricas introduciendo el vector de expresión en una línea celular de insecto; en el que la composición comprende adicionalmente una proteína vehículo conjugada con dicha proteína quimérica.

Método y composición para alterar una patología mediada por células B.

Campo de la invención 5

Esta invención se refiere en líneas generales al campo de la inmunología e inmunoterapia. Más específicamente, esta invención se refiere a composiciones para terapia de linfomas de células B.

Antecedentes de la invención 10

El sistema inmune produce respuestas tanto mediadas por anticuerpos como mediadas por células. Cada tipo de respuesta inmune está regulada por un tipo de linfocito, células B (para respuesta mediada por anticuerpos) y células T (para respuesta mediada por células) . Las células B inician el reconocimiento de un antígeno cuando el antígeno se une a las moléculas IgM e IgD en la superficie de las células B. Cada clon de célula B reconoce 15 solamente antígenos específicos debido al idiotipo único de ese clon. Tras el reconocimiento del antígeno, las células B internalizan y procesan el antígeno para la presentación mediante moléculas MHC de clase II. Las células B pueden por tanto funcionar como célula presentadora de antígeno ("APC") para células T. Las células T se unen a partes de proteínas foráneas (antígenos) cuando partes de la proteína se asocian con una molécula del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC") , típicamente en una APC, en que el antígeno se digiere en fragmentos y se 20 presenta sobre la superficie de la APC unido a su MHC.

Varios tipos de cánceres tienen su origen en el sistema circulatorio. Entre los tipos principales están: leucemias, un neoplasma de la médula ósea y la sangre; mielomas, un cáncer de células B; y linfomas, un grupo de cánceres que se originan en el sistema linfático. Los linfomas pueden clasificarse adicionalmente en varios grupos; uno de estos 25 grupos son los linfomas no Hodgkin que, a su vez, forman un grupo diverso de cánceres. Se definen tres amplias categorías de estos linfomas de acuerdo con la International Working Formulation para la clasificación de tumores, de grado bajo, grado intermedio y grado alto, que difieren en su capacidad de curación y agresividad (Cheson, et al., "Report of an International Workshop to Standardize Response Criteria for Non-Hodgkin's Lymphomas, " J. Clin Oncol. 17 (4) : 1244, 1999) . Globalmente, estos linfomas colectivamente están en el quinto puesto de la clasificación 30 en los Estados Unidos en términos de incidencia del cáncer y mortalidad, y se diagnostican aproximadamente 50.000 nuevos casos cada año.

En un estudio reciente que examinó cincuenta y un casos de aislados de linfoma no Hodgkin (NHL) de alto grado, treinta y tres mostraron derivar de células B mientras que ocho mostraron derivar de células T (Brown et al., 35 Histopathology 14:621-27, 1989) . Por lo tanto, serían valiosos tratamientos dirigidos específicamente a células B patológicas en el tratamiento de linfomas no Hodgkin y mielomas.

Los intentos iniciales en el campo de desarrollar un tratamiento basado en inmunología dirigido a antígenos producidos únicamente por células B malignas implicó un aislamiento laborioso y la purificación de proteínas 40 idiotípicas (Id) directamente de las células B patológicas. Esta proteína purificada primero se usó en sistemas modelo para tratar el linfoma asociado. Se demostró que esta inmunización activa contra determinantes idiotípicos en proteínas aisladas podía producir resistencia al crecimiento tumoral en un sistema modelo de ratón (Daley et al., J.Immunol. 120 (5) : 1620-24, 1978; Sakato et al., Microbiol. Immunol. 23 (9) : 927-31, 1979) . Este fenómeno de resistencia al crecimiento tumoral se ha reproducido posteriormente en varios modelos de tumor experimental 45 adicionales (Stevenson et al., J.Immunol. 130 (2) :970-03, 1983; George et al., J.Immunol. 141 (6) :2168-74, 1988; Kwak, et al., Blood 76 (11) :2411-17, 1990) .

Entre los primeros intentos en llevar esta idea y tecnología al entorno clínico estuvo un proceso muy laborioso y que utilizó anticuerpos monoclonales de ratón generados contra proteínas aisladas de linfomas individuales de pacientes 50 después de biopsia. Meeker y sus colaboradores generaron anticuerpos monoclonales de ratón anti-idiotipo para el tratamiento de once pacientes después de que la mayoría hubieran experimentado terapia convencional contra linfoma (Meeker et al., Blood 65:1349-63, 1985) . Se obtuvieron resultados positivos en casi la mitad de los pacientes, con un caso de remisión aparente. En algunos de los pacientes, sin embargo, las células de linfoma desarrollaron resistencia al anticuerpo mediante cambio de clase de los anticuerpos expresados en la superficie 55 celular (Meeker et al., N Engl J Med. 312:1658-65, 1985) .

Otro modo en que un clon de linfoma de células B desarrolló resistencia contra anticuerpos anti-idiotípicos es mediante mutación somática en la región CDR2 (Clear y et al., Cell 44:97-106, 1986) , evadiendo de este modo el reconocimiento. Aunque este enfoque de inmunidad pasiva para el tratamiento tiene la ventaja de que solamente 60 requiere el aislamiento y purificación de una cantidad relativamente minoritaria de proteína idiotípica de un paciente para crear una respuesta inmune en un ratón, la utilidad para tratar linfomas con anticuerpos monoclonales dirigidos a idiotipos es limitada. En ausencia de un modo robusto y conveniente para producir grandes cantidades de proteína idiotípica, sin embargo, esto podría resultar ser solamente el modo práctico de explotar las capacidades del sistema inmune para atacar directamente al idiotipo de un linfoma de células B. 65

Kwak et al. persiguieron un enfoque diferente e intentaron la inmunización activa de pacientes usando proteínas purificadas de sus propios linfomas únicos a pesar del requisito logístico de aislar grandes cantidades de proteínas idiotípicas (Kwak et al., N. Engl. J. Med. 327:1209-15, 1992) . Pacientes que tenían un mínimo de enfermedad o no tenían enfermedad después de quimioterapia se trataron con vacunación con proteínas de idiotipo autólogo. Para obtener suficientes cantidades de proteínas idiotípicas para la vacunación, se fusionaron células de linfoma 5 obtenidas por biopsia con una línea celular establecida para facilitar su crecimiento en cultivo tisular, y las proteínas secretadas de idiotipo se purificaron por cromatografía. La aplicación a gran escala de este método de inmunización se ve excluida debido a las necesidades extremadamente laboriosas, barreras técnicas, y costes prohibitivos. Adicionalmente, recientemente han surgido cuestiones referentes a las cargas virales asociadas con la producción de proteínas en células de mamífero. 10

En un artículo posterior, Hsu et al. informaron sobre la fase I/II del ensayo clínico anterior utilizando vacunación del idiotipo conjugado a hemocianina de lapa californiana (KLH) en el tratamiento de linfoma de células B (Hsu et al., Blood 89: 3129-35, 1997) . Después de quimioterapia convencional, 41 pacientes con linfoma de células B no Hodgkin refractario se vacunaron con un idiotipo específico de tumor. Según Kwak et al. (1992) , supra, los antígenos 15 de idiotipo específicos de tumor se obtuvieron por purificación cromatográfica de proteínas producidas por los hibridomas de los pacientes. Estas proteínas, por lo tanto, estaban compuestas por las regiones variable y constante completas de la propia inmunoglobulina del paciente procedentes de los linfomas de los pacientes. Los resultados mostraron que la generación de una respuesta anti-idiotipo se correlacionaba con un resultado clínico mejorado. La duración de ausencia de progreso de la enfermedad y la supervivencia global de todos los pacientes que montaban 20 una respuesta inmune celular anti-idiotipo se prolongaron significativamente en comparación con aquellos pacientes que no montaron una respuesta inmune. Este estudio confirma que pacientes con linfomas de células B pueden inducirse a crear una respuesta inmune específica contra la proteína de idiotipo tumoral (Id) . Además, la capacidad de generar una respuesta inmune anti-idiotipo se correlaciona con un resultado clínico más favorable. Sin embargo, para tratar a cada paciente individual, deben fusionarse las células de linfoma obtenidas por biopsia para establecer 25 líneas celulares para permitir la producción de suficiente proteína para vacunar a un paciente típico. Este proceso sería difícil o impracticable para su uso a escala comercial.

Más recientemente, Bendandi et al. demostraron remisiones inducidas por vacunación específica de paciente, idiotípica en pacientes con linfoma folicular (Bendandi et al., Nat. Med. 5:1171-77, 1999) . Después de quimioterapia 30 convencional, veinte pacientes que mostraron remisión clínica completa se vacunaron usando proteínas... [Seguir leyendo]

1. Uso de una primera proteína quimérica y una segunda proteína quimérica para la fabricación de una composición para terapia de un linfoma de células B en un paciente humano,

en el que dicha primera proteína quimérica comprende al menos una parte de una región VH y al menos una parte de 5 una región constante de inmunoglobulina IgM; y

en el que dicha segunda proteína quimérica comprende al menos una parte de una región VL y al menos una parte de una segunda región constante de inmunoglobulina;

en el que dicha fabricación comprende producir dichas proteínas quiméricas por un método que comprende:

(a) aislar un gen que codifica dicha parte de dicha región VH a partir de células B asociadas con dicho linfoma de células B del paciente;

(b) insertar dicho gen que codifica dicha parte de dicha región VH y un gen que codifica dicha parte de dicha región constante de inmunoglobulina IgM en un vector de expresión para permitir la expresión de dicha primera proteína quimérica; 15

(c) aislar un gen que codifica dicha parte de dicha región VL a partir de células B asociadas con dicho linfoma de células B del paciente;

(d) insertar dicho gen que codifica dicha parte de dicha región VL y un gen que codifica dicha parte de dicha segunda región constante de inmunoglobulina en un vector de expresión para permitir la expresión de dicha segunda proteína quimérica; y 20

(e) producir dichas proteínas quiméricas introduciendo el vector de expresión en una línea celular de insecto;

en el que la composición comprende adicionalmente una proteína vehículo conjugada con dicha proteína quimérica.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha región VH o VL es una región variable completa. 25

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha proteína vehículo es hemocianina de lapa californiana (KLH) .

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha composición es para 30 co-administración con una citoquina o quimioquina.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha citoquina es el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) .

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha quimioquina es la proteína quimiotáctica de monocitos 3 (MCP 3) .

7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición es para administración por inyección, inhalación, suministro oral o transdérmico. 40

8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho linfoma de células B es un linfoma de grado bajo refractario o linfoma folicular de células B.

9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho linfoma de células B es 45 linfoma no Hodgkin.

10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho vector de expresión de baculovirus comprende una secuencia señal secretora de la melitina de abeja melífera y una secuencia señal secretora de la fosfatasa alcalina placentaria humana.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho vector de expresión de baculovirus comprende 55 adicionalmente un promotor p10 del baculovirus AcNPV y un promotor de polihedrina de AcNPV, en el que dicho promotor p10 controla una secuencia señal secretora de la melitina de abeja melífera, y en el que dicho promotor de polihedrina controla una secuencia señal secretora de la fosfatasa alcalina placentaria humana.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho gen que codifica una proteína quimérica que 60 comprende una región VH y una región constante de inmunoglobulina IgM está controlado por dicho promotor p10 en dicho vector de expresión de baculovirus, y dicho gen que codifica una proteína quimérica que comprende una región VL y una segunda región constante de inmunoglobulina está controlado por dicho promotor de polihedrina en dicho vector de expresión de baculovirus.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho gen que codifica dicha región VH o VL y dicha región constante de inmunoglobulina está controlado por dicho promotor p10 o dicho promotor de polihedrina en dicho vector de expresión de baculovirus.

15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha línea celular de 5 insecto es una línea celular de Trichoplusia ni (Hi-5) o Spodoptera frugiperda (sf9) .

16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas proteínas quiméricas se analizan para su expresión por ELISA.

17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas proteínas quiméricas se aíslan usando una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en proteína A, proteína G, proteína L y otras proteínas que son capaces de unirse a un dominio de unión de inmunoglobulina.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicha proteína capaz de unirse a un dominio de unión de 15 inmunoglobulina es un anticuerpo anti-inmunoglobulina.