La invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo,

para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STRs en un extracto de ADN de dicho individuo mediante una reacción de amplificación multiplex empleando un conjunto de parejas de cebadores especialmente diseñado para dicho propósito. Así, la invención también se relaciona con dicho conjunto de parejas de cebadores, el kit que los comprende y los usos de dichos cebadores.

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DEL PERFIL GENETICO DE UN INDIVIDUO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STRs en un extracto de ADN de dicho individuo mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex. Dicho método es de aplicación en la identificación de individuos en el área de la genética forense, así como en genética de poblaciones, antropología y biomedicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Salvo los gemelos monocigóticos, no existen dos personas cuyo material genético (ADN) nuclear sea idéntico. Determinadas regiones del ADN conocidas como STRs (Short Tandem Repeats) se caracterizan por su alta variabilidad entre individuos y a lo largo de las dos últimas décadas, han constituido el material de elección para la obtención de perfiles genéticos, los cuales pueden emplearse tanto en la identificación de personas como en la determinación de relaciones de parentesco entre individuos. De la misma manera, los STR se utilizan en la elaboración de bases de datos de perfiles genéticos en países de todo el mundo, como por ejemplo, la base de datos CODIS (Combined DNA Index System) que incluye los loci STRs CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 y D21S11, también incluidos en la base de datos nacional de los Estados Unidos para la búsqueda de perfiles de ADN durante la investigación de delitos criminales. Por otro lado, la base de datos Europea y la base del datos del Reino Unido incluyen algunos de los loci STRs del CODIS, como son FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11 y el locus de sexo amelogenina (AMEL) , además del locus STR D2S1338 .

En la actualidad existen numerosas empresas que comercializan kits para la elaboración de perfiles genéticos. Applied Biosystems® comercializa AmpFlSTR® Identifiler® PCR amplification kit (2004, Applied Biosystems®, Foster City, CA) y Promega fabrica PowerPlexTM 16 (2004, Promega® Corporation, USA) . Mediante estos kits puede alcanzarse una probabilidad de coincidencia entre los perfiles genéticos de dos individuos de alrededor de uno entre un trillón, tras el análisis de 15 regiones STRs. Ambos kits incluyen los 13 loci del CODIS; en el caso de Identifiler® incluye además los loci autosómicos D2S1338 y D19433, y PowerplexTM 16 incluye los loci autosomicos Penta E y Penta D.

Recientemente se han desarrollado los kits comerciales AmpFlSTR® NGM TM Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) , PowerPlex® ES X y PowerPlex® ES Y (Promega® Corporation, USA) que que permiten analizar algunos de los loci recomendados para ser incluidos en las bases de datos nacionales.

Uno de los principales inconvenientes de estos y otros kits de análisis actuales es su falta de capacidad para proporcionar perfiles genéticos que incluyan la totalidad de los loci recogidos actualmente en el CODIS a partir de de extractos de ADN altamente degradados, lo que disminuye su rendimiento en cuanto a comparación de los resultados obtenidos con los millones de perfiles genéticos disponibles en esta base de datos. La degradación del ADN se caracteriza por una fragmentación general del material genético, donde los fragmentos de ADN pueden rondar las 240 pb mientras que estos kits necesitan al menos de fragmentos de unas 450 pb para el análisis de todos los loci STRs que incluyen. El ADN altamente degradado es una característica de la mayoría de las muestras que se analizan en los laboratorios de genética criminalística. En estos casos se produce la ausencia de resultados o incluso la obtención de resultados erróneos, con las graves repercusiones judiciales y/o personales que ello puede conllevar.

Con la finalidad de conseguir perfiles genéticos de muestras cuyo ADN está muy degradado, se han realizado numerosos esfuerzos para desarrollar reacciones que posibiliten la obtención de perfiles genéticos suficientemente discriminativos en extractos de ADN altamente degradados, (Lygo et al., 1994 Int. J. Legal Med. 107:77-89; Whitaker et al., 1995, BioTechniques 18 (4) :670-677) .

Schilz, F. et al. 2004 (Anthrop. Anz., 4: 369-378) describieron una reacción PCR multiplex capaz de amplificar simultáneamente fragmentos de corta longitud de 16 loci STRs y el locus amelogenina (de 84pb a 275pb) . Sin embargo en esta reacción multiplex solo se consideraron alelos presentes al menos en el 1% de los caucasoides, por lo que su utilización puede derivar en un perfil genético erróneo en el 16 % de los casos en que la muestra biológica analizada provenga de un individuo de origen caucasoide, error que puede incluso incrementarse en el análisis de individuos de otros orígenes étnicos.

Okamoto, O. et al. 2003 (Acta Medica Okayama, 57 (2) : 59-71) describe el empleo del kit comercial PowerPlex™ 16 System para estimar las frecuencias genotípicas y fenotípicas de 15 STRs loci en la población japonesa.

En 2003, John Butler et al., publicaron el desarrollo de reacciones multiplex que analizan entre 3 y 6 loci STRs mediante la amplificación de fragmentos de pequeño tamaño, para su aplicación en extractos de ADN degradado (Butler et al., J. Forensic Sci 48 (5) :1054-1064) . En 2006 Applied Biosystems comenzó a comercializar AmpFlSTR® MiniFiler™ (Mulero et al., J Forensic Sci. 2008 Jul;53 (4) :838-52, Luce et al., 2009. J Forensic Sci.Sep;54 (5) :1046-54) , mediante el cual pueden obtenerse resultados con fragmentos de ADN de tamaño reducido. Por contra, el perfil genético proporcionado por AmpFlSTR®MiniFiler™ se compone de solamente 8 loci STRs más amelogenina, por lo que aunque tiene la ventaja de posibilitar la obtención de resultados en muestras de ADN degradadas que otros kits no permiten, sus resultados resultan insuficientes para la determinación de la mayoría de relaciones de parentesco que son habituales en la identificación de restos de personas desaparecidas o en casos de graves accidentes o catástrofes.

En este contexto han surgido numerosas solicitudes de patentes, relacionadas con la obtención de perfiles genéticos mediante el análisis simultáneo de varios loci STRs, que describen nuevos métodos de obtención de perfiles genéticos cada vez más discriminativos basados en el análisis de nuevos STRs además de incluir algunos de los loci STRs analizados hoy día, o bien metodologías capaces de reportar resultados en el análisis de extractos de ADN altamente degradados.

La solicitud de patente US6090558 describe el uso de la espectrometría de masas para detectar la variación de longitud en repeticiones de secuencias de nucleótidos, tales como microsatélites y repeticiones cortas en tándem, y cebadores de ADN para el análisis de polimorfismos en repeticiones de nucleótidos en tándem en loci específicos.

Tanto la solicitud de patente US6479235 como la patente ES2273367 describen la detección de loci genéticos, más específicamente, la amplificación simultánea de múltiples loci genéticos polimórficos diferentes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa u otros sistemas de amplificación para determinar los alelos de cada locus. Los loci genéticos amplificados comprenden HUMvWFA31, HUMLIPOL, HUMBFXIII, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMTH01, HUMTPOX, HUMCSF1PO, D22S683, D20S481, D19S253, D17S1299, D17S1298, D16S753, D16S539, D16S490, D14S562, D14S548, D14S118, D13S317, D10S1239, D9S930, D7S820, D5S818, D4S2368, D3S1539. Aunque analiza un alto número de loci STRs, incluye únicamente 8 de los 13 loci objeto del CODIS, y 3 de los 10 loci incluidos en la base de datos europea, lo que disminuye su rendimiento en cuanto a comparación de los resultados obtenidos con los millones de perfiles genéticos disponibles en las bases de datos existentes.

La solicitud de patente US6479235 describe métodos y materiales para la amplificación simultánea de, al menos, 13 STRs del CODIS en una reacción multiplex sencilla cuyos tamaños de amplificado exceden las 360pb.

La solicitud de patente US2003/0186272 describe un método rápido para determinar la longitud de los fragmentos de los alelos presentes en una pluralidad de loci en una muestra que contiene ADN que comprende (a) obtener una muestra que contiene ADN, b) amplificar mediante PCR multiplex una pluralidad de loci que comprenden FGA, vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 y D21S11, donde dicha reacción PCR... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos que comprende el análisis de loci STR en un extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos mediante, al menos, una reacción de amplificación multiplex, en donde las parejas de cebadores de dicha reacción de amplificación multiplex comprenden las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (D5S818) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (D7S820) , SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D21S11) , SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (VWA) , SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D8S1179) , SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D19S433) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) , SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D16S539) , SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (D3S1358) , SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D18S51) , SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (D13S317) , SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) , y SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 (FGA) ,

con la condición de que si se lleva a cabo una reacción de amplificación multiplex adicional, las parejas de cebadores empleadas en dicha reacción de amplificación adicional no sean el conjunto de parejas de oligonucleótidos que consisten en SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 33 (FGA) , SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D18S51) , SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (VWA) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) , SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D21S11) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 40 (D7S820) , SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 (D2S1338) , SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 (D13S317) , SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) , y SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 (D5S818) .

2. Método según la reivindicación 1, en donde el análisis de loci STRs comprende, además, una segunda reacción de amplificación multiplex del extracto de ADN procedente de dicho individuo o dichos restos humanos, en donde las parejas de cebadores de dicha segunda reacción de amplificación multiplex comprenden una pareja de cebadores caracterizada porque:

- amplifica uno de los locus amplificados en la primera reacción de amplificación y

- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de la pareja de cebadores que en la primera reacción de amplificación amplifica el mismo locus.

3. Método según la reivindicación 2, en donde las parejas de cebadores de la segunda reacción de amplificación multiplex se seleccionan de entre las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 33 (FGA) , SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D18S51) , SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (VWA) , SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D21S11) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 40 (D7S820) , SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 (D13S317) , SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 (D5S818) .

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en donde la segunda reacción de amplificación multiplex adicionalmente comprende al menos 1, 2 ó 3 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) y SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 (D2S1338)

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 30 está comprendida entre 57 y 63º C.

6. Método según la reivindicación 3 ó 4, en donde

(i) la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 30 está comprendida entre 57 y 63º C, y

(ii) la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende la segunda reacción de amplificación multiplex está comprendida entre 58 y 60º C.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.

8. Método según la reivindicación 7, en donde los compuestos empleados en el marcaje de los oligonucleótidos seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.

9. Método según la reivindicación 8, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-FAM) , 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET) , análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX) , 6carboxitetrametilrodamina (TAMRA) , 6-carboxi-X-rodamina (ROX) , 6-carboxi-4', 5'dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE) , NED (ABI) , Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC) .

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el extracto de ADN procede de una muestra de sangre, pelo, saliva, epidermis, esperma, caspa, cenizas, una muestra vaginal y una muestra de tejido.

11. Kit que comprende las parejas de cebadores que comprende las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (D5S818) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (D7S820) , SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D21S11) , SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (VWA) , SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D8S1179) , SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D19S433) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) , SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D16S539) , SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (D3S1358) , SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D18S51) , SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (D13S317) , SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) , y SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 (FGA) ,

con la condición de que adicionalmente no comprenda el conjunto de parejas de cebadores que consiste en las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 33 (FGA) , SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D18S51) , SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (VWA) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) , SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D21S11) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 40 (D7S820) , SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 (D2S1338) , SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 (D13S317) , SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) , y SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 (D5S818) .

12. Kit según la reivindicación 11, que comprende adicionalmente, una pareja de cebadores caracterizada porque:

- amplifica uno de los locus amplificados por las parejas de cebadores de la reivindicación 11 y

- uno de los cebadores de la pareja presenta una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia de nucleótidos de las parejas de cebadores de la reivindicación 11 que amplifica el mismo locus.

13. Kit según la reivindicación 12, en donde las parejas de cebadores se seleccionan del grupo que consiste en las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 33 (FGA) , SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 (D18S51) , SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 (VWA) , SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39 (D21S11) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 40 (D7S820) , SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 (D13S317) , SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) y SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47 (D5S818) .

14. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 que comprende, adicionalmente, al menos, 1, 2 ó 3 de las parejas de cebadores seleccionadas de las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) y SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 (D2S1338) .

15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que además, comprende, los reactivos necesarios para marcar las parejas de cebadores.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.

17. Kit según la reivindicación 15 ó 16, en donde los compuestos empleados en el marcaje de los oligonucleótidos seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.

18. Kit según la reivindicación 17, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-FAM) , 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET) , análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX) , 6carboxitetrametilrodamina (TAMRA) , 6-carboxi-X-rodamina (ROX) , 6-carboxi-4', 5'dicloro-2', 7'-dimetoxifluoresceína (JOE) , NED (ABI) , Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC) .

19. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

20. Un conjunto de parejas de cebadores que comprende las siguientes parejas de oligonucléotidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (CSF1PO) , SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (D5S818) , SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (D7S820) , SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (D21S11) , SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 (TPOX) , SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (VWA) , SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 (D8S1179) , SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 (D19S433) , SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 (TH01) , SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 (D16S539) , SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 (D3S1358) , SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 (D18S51) , SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 (D13S317) , SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 (Amelogenina) , y SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 (FGA) .

21. Uso de un conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 20 para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201031269

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 19.08.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12Q1/68 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

26. 270. ISSN 0379-0738. X COBLE M. D. et al. "Characterization and performance of new MiniSTR loci for typing degraded samples". INTERNATIONAL CONGRESS SERIES. 01.04.2006. Vol. 1288, página.

50. 506. ISSN 0531-5131. 1-21 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 26.03.2012 Examinador J. Manso Tomico Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201031269

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12Q Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, EMASE, BIOSIS, MEDLINE, NPL

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031269

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 26.03.2012

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031269

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

26. 270. ISSN 0379-0738. D05 Coble M. D. et al. "Characterization and performance of new MiniSTR loci for typing degraded samples". INTERNATIONAL CONGRESS SERIES. 01.04.2006. Vol. 1288, página.

50. 506. ISSN 0531-5131.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente solicitud divulga una combinación de parejas de cebadores para la identificación de un perfil de marcadores STR, que empleados en una reacción de amplificación multiplex sobre un extracto de ADN procedente de un individuo, permiten obtener perfiles genéticos con un alto poder de discriminación a partir de extractos de ADN altamente degradados. D01 divulga un método que comprende: (a) la co-amplificación de un set de locis de una muestra de ADN mediante una reacción de amplificación multiplex, donde el set de locis comprende 10 STR loci D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, D2S1338, D3S1358, D8S1179, FGA, TH01, VWA; y uno más de entre los siguientes loci STR: D10S1248, D12S391, D1S1656, D22S1045, and D2S441; and (b) la evaluación de los alelos amplificados para determinar el perfil genético presente en la muestra analizada. D02 describe métodos y materiales para la amplificación simultánea de, al menos, 13 marcadores STR, incluidos en CODIS, en una reacción multiplex sencilla, cuyos tamaños de amplicón exceden las 360pb. En D03 se describe un método rápido para determinar la longitud de los fragmentos de los alelos presentes en una pluralidad de loci en una muestra que contiene ADN que comprende (a) obtener una muestra que contiene ADN, b) amplificar mediante PCR multiplex una pluralidad de loci que comprenden FGA, vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 y D21S11, donde dicha reacción PCR multiplex se lleva a cabo empleando una pluralidad de parejas de cebadores, donde al menos, un cebador de cada pareja de cebadores está marcado con una etiqueta detectable, y la amplificación produce una mezcla de amplicones marcados, y (c) analizar por electroforesis dicha mezcla de amplicones loci, donde dicha etapa de análisis permite la determinación de la longitud de los fragmentos de 5 los alelos en dicha pluralidad de loci de la muestra que contiene ADN. D04 describe un trabajo donde se determinaron la frecuencia alélica de 15 marcadores STR, en concreto: CSF1PO, FGA, THO1, TPOX, VWA, D3S11358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D19S433 and D2S1338, haciendo uso del Kit AmpFlSTR Kit, comprobando la utilidad del método en estudios étnicos comparativos, así como en estudios de paternidad, e identificación en el campo forense. Finalmente D05 divulga un estudio donde se describen 10 marcadores mini STR no incluidos en el CODIS para la amplificación de muestras de ADN de pequeño tamaño en muestras degradadas tales como manchas de sangre o trozos de pelo La diferencia entre D01 y el objeto de la presente solicitud sería la distinta combinación de los marcadores STR analizados. El efecto técnico producto de la diferencia sería el aumento de la fiabilidad de los resultados sobre muestras de ADN degradadas, o donde la cantidad inicial de partida fuera escasa. Por tanto, el problema técnico que pretende resolver la invención sería la provisión de una metodología para la obtención de perfiles genéticos donde se lleve a cabo el análisis de un alto número de marcadores STR. La solución propuesta sería la combinación de las parejas de oligos reivindicadas que permiten la identificación de los loci STR agrupados en los conjuntos identificados como I-DNA1, I-DNA2, de la presente solicitud Ninguno de los documentos del estado de la técnica divulga una combinación de marcadores STR idénticos a los reivindicados, por lo que las reivindicaciones 1-21 cumplirían con el requisito de novedad tal y como se menciona en el art. 6de la ley 11/1986.Sin embargo tales reivindicaciones no parecen ser inventivas. Dado que son conocidas distintas bases de datos que contienen distintos loci para la obtención de perfiles genéticos como son CODIS (Combined DNA Index System) , o las bases de datos Europea y del Reino Unido (descripción página 1) , sería obvia la adición y combinación de distintos loci que aparecen en estas bases de datos como alternativas a los sets de loci STR ya existentes a la hora de enfrentarse con el problema de la mejora en la identificación de perfiles genéticos en muestras de ADN degradadas. Una vez seleccionados los loci STR a analizar tanto el diseño de los oligonucleótidos utilizados para amplificar cada loci, y la optimización de las condiciones para llevar a cabo la metodología adecuada, carecerían de actividad inventiva, pues es algo que es materia de rutina dentro del ámbito de experimentación de este tipo de métodos de amplificación, tal y como se puede apreciar en los distintos documentos del estado de la técnica citados. Igualmente las reivindicaciones de Kit no serían inventivas puesto que la inclusión de una combinación de oligonucleótidos amplificadores de STR no inventivos no hace que los Kits sean inventivos. Por tanto, las reivindicaciones 1-21 no cumplirían con el requisito de actividad inventiva tal y como se menciona en el art. 8 de la ley 11/1986.

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