MÉTODO DE OBTENCIÓN DE DATOS ÚTILES PARA EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LA ESCLERODERMIA.

Método de obtención de datos útiles para el diagnostico diferencial de la esclerodermia.

Uso de la proteína CENPI, o de una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes, y en particular, de la esclerodermia.

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial de la la esclerodermia.

La presente invención se encuentra dentro de la medicina, la biología molecular y la inmunología, y se refiere al uso de la proteína CENPI, o de una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de dicha proteína, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes, y en particular, de la esclerodermia. También se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de la esclerodermia, permitiendo el establecimiento de grupos de pacientes, así como el diagnóstico precoz.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La esclerodermia ("piel endurecida") , también llamada esclerosis sistémica progresiva y síndrome de CREST, es una enfermedad del tejido conectivo difuso caracterizada por cambios en la piel, vasos sanguíneos, músculos esqueléticos y órganos internos. Se desconoce (n) la (s) causa (s) de esta enfermedad, o bien; es un conjunto de enfermedades que afectan el tejido conectivo del cuerpo. La esclerodermia hace que el tejido conectivo se endurezca y se ponga grueso. También puede causar hinchazón o dolor en los músculos y en las articulaciones.

enfermedades, especialmente las del tejido conectivo, como artritis reumatoide sus síntomas son comunes o pueden coincidir con los de otras

en las primeras etapas. Muchos y lupus. Los distintos síntomas pueden desarrollarse por etapas a través de un largo período, y pocas personas con esclerodermia experimentan exactamente los mismos síntomas y efectos.

Aunque la esclerodermia puede ser detectada por sus síntomas más visibles, la existencia del padecimiento no puede comprobarse mediante una única prueba.

El diagnóstico lo suelen dar los médicos con amplia experiencia en el

tratamiento de esta enfermedad teniendo en cuenta:

el historial médico, incluyendo los síntomas pasados y los del

presente;

un minucioso examen físico y pruebas realizadas en una gran variedad de tests y otros estudios. Al hacer el diagnóstico, es importante no sólo confirmar la presencia de la esclerodermia, sino también su alcance y gravedad, pues hay que considerar la implicación de los órganos internos.

La esclerodermia limitada y difusa a veces pueden determinarse por la presencia de distintos anticuerpos en la sangre, llamados anticuerpos antinucleares (ANA) , que son autoanticuerpos que tienen como blanco el contenido del núcleo celular, y dentro de los que se encuentran los autoanticuerpos anticentrómero.

Los autoanticuerpos anticentrómero (ACA) se identificaron por vez primera en humanos en los años 80 por Moroi y colaboradores en un paciente de esclerodermia (SSc) mediante el análisis de inmunofluorescencia indirecta (Moroi et al., 1980. Proc Natl Acad Sci USA 77: 1627-31. Desde entonces, los ACA han demostrado ser altamente específicos para SSc generalmente y más comúnmente estar presentes en pacientes con la forma cutánea limitada de la enfermedad (lcSSc) . Estos autoanticuerpos (autoAb) se pueden también detectar en sueros de pacientes con el fenómeno de Raynaud sin desorden reumático definido y en otras enfermedades autoinmunes reumáticas tales como síndrome de Sjogren, cirrosis biliar primaria, y artritis reumatoide (Van Venrooij & Van de Putte, 1991. Semin Clin /mmuno/2: 27-32; Rothfield 1992. Rheum Oís Clin North Am 18: 483-98) , entre otras.

Las proteínas principales del centrómero detectadas por el ACA son CENPA, CENPB y CENPC (Earnshaw & Rothfield 1985. Ghromos 91: 313-21) . Circunstancialmente, algunos sueros positivos humanos con ACA fueron demostrados contener autoanticuerpos dirigidos contra CENPD, CENPE, CENPF, y CENPG (Rattner et al., 1993. Gel/ Moti/ Cytoske/26: 214-26; Rattner et al., 1996. Arthr Rheum 39: 1355-61 ) . Recientemente, otra proteína localizada en el cinetocoro a través del ciclo celular, CENPH, fue descrita como nuevo autoantigeno del centrómero en pacientes con el síndrome de Sjogren (Hsu et a/., 2006. Rheumatol 26: 298-303) . También, CENPO, un nuevo componente del cinetocoro, fue descrito como nuevo antígeno en la esclerosis sistémica (Saito et al., 2009. J. Rheumatol 36: 781-86) . Finalmente, el autoAb contra la proteína centromérica facultativa INCENP también fue detectado en un paciente con el síndrome de Graham Little Piccardi-Lassueur (Rodríguez-Sayona et al., 2007. J Autoimm Dis 4:1 ) .

La proteína CENPI del centrómero es una proteína constitutiva del ensamblaje del cinetocoro, una estructura del centrómero de los cromosomas que desempeña un papel esencial durante la progresión de la mitosis (Okada et al., 2006. Nat Gel/ Biol 5: 446-57) .

Hasta el momento no se ha demostrado ningún papel directo de los autoanticuerpos en la patología de la esclerodermia. Sin embargo, más del 95% de pacientes con SSc tiene anticuerpos (Ab) antinucleares (Naparstek et al., 1993. Annu Revlmmunol 11: 79-104) .

Por tanto, dada la dificultad del diagnóstico, especialmente en las primeras etapas, sigue siendo fundamental encontrar un método para el diagnóstico de la esclerodermia, así como para el seguimiento del transcurso de la misma y determinar su gravedad, para eliminar o reducir al mínimo los procesos patológicos que causan efectos negativos, en los pacientes, así como el diagnóstico precoz.

.DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

5 La presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes, y preferentemente de la esclerodermia, así como para evaluar su alcance y gravedad.

1 O 15 Los autores de la presente invención han analizado las posibles respuestas contra la proteína CENPI del centró mero. Han encontrado, por análisis de inmunofluorescencia (IF) y de immunoblots con una proteína centromérica recombinante de CENPI, un número significativo de pacientes de esclerodermia que contienen autoAb contra dicha proteína. Se ha observado que un número significativo de los pacientes con anticuerpos anti-CENPI presentaron a la vez autoAb característicos de la enfermedad autoinmune hepática. La presencia de autoAb anti-CENPI en pacientes con esclerodermia tiene potencial en el diagnóstico clínico.

20 25 Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de la proteína CENPI, de una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, propnóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad autoinmune es la esclerodermia. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad autoinmune es la esclerodermia.

30 Más preferiblemente, la secuencia aminoacídica de la variante de la proteína CENPI presenta una identidad de, al menos, un 80%, y más preferiblemente al menos un 85%, un 90%, un 91 %, un 92%, un 93%, un 94%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98%, o un 99% con el péptido de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Aún más preferiblemente es la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI) , de secuencia SEQ ID NO: 2, una variante o un fragmento

funcionalmente equivalente. Más preferiblemente es la región carboxiloterminal de la proteína CENPI (Ct-CENPI) , de secuencia SEQ ID NO: 4, una variante o un fragmento funcionalmente equivalente.

El término "identidad", tal y como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.

En esta memoria se entiende por enfermedades autoinmunes o enfermedades autoinmunitarias aquellas enfermedades causadas porque el sistema inmunitario ataca las células del propio organismo. En este caso, el sistema inmunitario se convierte en el agresor y ataca a partes del cuerpo en vez de protegerlo. Existe una respuesta inmune exagerada contra sustancias y tejidos que normalmente están presentes en el cuerpo. Las causas son un tanto desconocidas, pero está relacionada con el reconocimiento proteico entre las superficies de las membranas celulares del sistema inmunitario y las que forman el organismo. Así, cuando las glucoproteínas de reconocimiento no coinciden, el sistema inmunitario comienza a atacar al propio organismo. La causa por tanto, tiene que ver a veces con la predisposición o mutación genética que codifican proteínas diferentes bien en las células inmunitarias u orgánicas.... [Seguir leyendo]

1. Uso de la proteína CENPI, de una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de enfermedades autoinmunes.

2. Uso de la proteína CENPI, de una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI según la reivindicación anterior, donde la enfermedad autoinmune es la esclerodermia.

3. Uso de la proteína CENPI, una variante o de un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI según la reivindicación anterior, donde la enfermedad autoinmune es la hepatopatía autoinmune.

4. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes, que comprende:

a. obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b. detectar la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPI en la muestra biológica aislada de (a) ;

5. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes según la reivindicación anterior, que además comprende:

c. comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

6. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde en el paso

(b) se detecta la cantidad de anticuerpos frente a la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI) , o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma.

7. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde la región amino-terminal de CENPI (Nt-CENPI) es recombinante.

8. Método de diagnóstico de enfermedades autoinmunes, que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde en el paso (b) se detecta, además, la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPB, frente a una variante o frene a un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPB,

9. Método de diagnóstico de enfermedades autoinmunes, que comprende los pasos (a) - (c) según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, y además comprende asignar al individuo según el paso (a) al grupo de individuos con enfermedad autoinmune, cuando presenta una cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, frente a la región amino-terminal de CENPI (NtCENPI) , o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos detectados en el paso (b) , mayor y estadísticamente significativa a la cantidad de referencia de (c) .

10. Método de diagnóstico de enfermedades autoinmunes según la reivindicación anterior, donde la cantidad de referencia es uno o varios controles negativos presentes en pacientes con otras enfermedades autoinmunes.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde la enfermedad autoinmune es la esclerodermia.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde la enfermedad autoinmune es una hepatopatía autoinmune.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, donde la detección de la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI, CENPB y/o la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI) , o frente a una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de los mismos del paso

(b) , en la muestra biológica de (a) , se realiza mediante un inmunoensayo.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-13, donde la detección de la cantidad de anticuerpos frente a la proteína CENPI y/o la región amino-terminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI) del paso (b) , en la muestra biológica de (a) , se realiza mediante un Western blot.

15. Un Kit o dispositivo que comprende la proteína CENPI, la región aminoterminal de la proteína CENPI (Nt-CENPI) , o una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas.

16. El Kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que además comprende la proteína CENPB, una variante o un fragmento funcionalmente equivalente de la proteína CENPB.

17. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, en el diagnóstico y seguimiento de de enfermedades autoinmunes.

18.Uso de un kit según la reivindicación 17, donde la enfermedad autoinmune es la esclerodermia y/o una hepatopatía autoinmune