Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de las plantas.

Un método para estimular el crecimiento de la raíz o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende expresión en plantas o partes de plantas de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta seleccionado del grupo que consiste de:

(a) ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas,

(b) ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas,

(c) ácidos nucleicos que se hibridan específicamente a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o al complemento de las mismas,

(d) ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en la SEQ ID NO 2, o el complemento de las mismas,

(e) ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucleico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintético en donde T se reemplaza por U,

(f) un ácido nucleico que se degenera a un ácido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o que se degenera a un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e) como resultado del código genético, (g) ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en la SEQ ID NO 2 o que es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,

(h) ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) que son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

(i) ácidos nucleicos que codifican una proteína como se da en la SEQ ID NO 2, y

(j) fragmentos funcionales de ácidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa.

Mïtodo para modificar la morfologïa, bioquïmica y fisiologïa de las plantas Campo de la Invenciïn La presente invenciïn se relaciona en general con un mïtodo para modificar las propiedades o caracterïsticas morfolïgicas, bioquïmicas y fisiolïgicas de las plantas, tales como uno o mïs de sus procesos de desarrollo y/o sus procesos de adaptaciïn al ambiente, que incluyen la modificaciïn de la iniciaciïn o estimulaciïn o mejora del crecimiento de la raïz, y/o la formaciïn de raïces adventicias, y/o la formaciïn de raïces laterales, y/o geotropismo de las raïces, y/o crecimiento de brotes, y/o dominio apical, y/o a la ramificaciïn, y/o al periodo de senescencia, dicho mïtodo comprende expresar una proteïna de control de degradaciïn de citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la planta, funcionalmente bajo el control de una secuencia promotora regulable, tal como una secuencia promotora especïfica para la cïlula, promotora especïfica para el tejido, o promotora especïfica para un ïrgano. Preferiblemente, las caracterïsticas modificadas por la presente invenciïn son caracterïsticas mediadas por citoquinina y/o mediadas por auxina.

Antecedentes de la Invenciïn Las raïces son un ïrgano importante de las plantas superiores. Sus principales funciones son anclar la planta en el suelo y absorber agua y nutrientes (nutriciïn N, minerales, etc.) . Asï, el crecimiento de la raïz tiene una influencia directa o indirecta en el crecimiento y rendimiento de los ïrganos aïreos, particularmente bajo condiciones de limitaciïn de nutrientes. Las raïces tambiïn son relevantes para la producciïn de productos vegetales secundarios, tal como compuestos de defensa y hormonas de plantas.

Las raïces tambiïn son ïrganos de almacenamiento en un buen nïmero de cultivos importantes. La remolacha de azïcar es la planta mïs importante para la producciïn de azïcar en Europa (260 millones de toneladas/aïo, 38% de la producciïn mundial) . La mandioca (casaba) , ïames y patatas dulces (batatas) son tambiïn productores de almidïn importantes (aproximadamente 150 millones de toneladas/aïo cada una) . Su contenido en almidïn puede ser dos veces tan alto como el de la patata. Las raïces tambiïn son el ïrgano relevante para el consumo en una serie de vegetales (por ejemplo, zanahorias, rïbanos) , hierbas (por ejemplo, jengibre, cïrcuma) , y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng) . Adicionalmente, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados en las raïces son de importancia econïmica para la industria quïmica y farmacïutica. Un ejemplo son los ïames que contienen molïculas bïsicas para la sïntesis de hormonas esteroides. Otro ejemplo es la shiconina, que es producida por las raïces de la Lithospermum erithrorhizon en cultivos de raïces capilares. La Shikonina se utiliza por sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y para curaciïn de heridas.

Ademïs, el crecimiento de la raïces de las plantas de cultivo mejoradas tambiïn mejora la competitividad frente a la maleza y mejora el crecimiento en ïreas ïridas, al incrementar la accesibilidad y la adsorciïn de agua.

El crecimiento mejorado de las raïces tambiïn es relevante para propïsitos ecolïgicos, tales como la biorremediaciïn y la prevenciïn/detenciïn de la erosiïn del suelo.

La arquitectura de las raïces es un ïrea que ha permanecido durante mucho tiempo inexplorada a travïs de los cultivos clïsicos, debido a las dificultades al evaluar este rasgo en el campo. Asï, la biotecnologïa podrïa tener un impacto significativo en la mejora de este rasgo, puesto que no se basa en selecciones a gran escala en el campo. En cambio, los mïtodos biotecnolïgicos requieren de un entendimiento bïsico de los componentes moleculares que determinan una caracterïstica especïfica de la planta. Hoy, este conocimiento es solamente fragmentario, y como consecuencia, la biotecnologïa hasta ahora ha sido incapaz de alcanzar una profunda penetraciïn en esta ïrea.

Un regulador bien establecido del crecimiento de las raïces es la auxina. La aplicaciïn de ïcido indol-3-acïtico (IAA) a las plantas en crecimiento estimula el desarrollo de las raïces laterales y la elongaciïn de las raïces laterales (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely et al., BotGaz 143: 341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994) . Las raïces expuestas a un rango de concentraciones de IAA inician al aumentar los nïmeros de raïces laterales (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) . Adicionalmente, cuando las raïces habïan producido raïces laterales en respuesta a una concentraciïn particular de auxina exïgena fueron expuestas posteriormente a concentraciones mïs altas de IAA, se formaron numerosas raïces laterales supernumerarias espaciadas entre las existentes (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) . Por el contrario, el crecimiento de las raïces en agar que contiene inhibidores del transporte de la auxina, que incluye el NPA, reduce el nïmero de raïces laterales (Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994) .

Se han aislado mutantes de arabidopsis que contienen niveles incrementados de IAA endogeno (Boerjan et al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996) . Se conocen por ser alelos de un locus localizado en el cromosoma 2. Estas

plïntulas mutantes tienen raïces adventicias y laterales en exceso, lo que estï de acuerdo con los efectos anteriormente descritos de la aplicaciïn externa de auxina.

El efecto estimulador de las auxinas en la formaciïn de raïces adventicias y laterales sugiere que la sobreproducciïn de auxinas en las plantas transgïnicas es una estrategia vïlida para incrementar el crecimiento de las raïces. Aïn, tambiïn es cuestionable si esto producirïa un producto comercial con caracterïsticas mejoradas. A parte de su efecto estimulatorio sobre la formaciïn de las raïces adventicias y laterales, la sobreproducciïn de auxina dispara otros efectos, tales como la reducciïn en el nïmero de hojas, la morfologïa anormal de hojas (hojas estrechas, entorchadas) , inflorescencias abortadas, dominio apical incrementado, formaciïn de raïces adventicias en el tallo, la mayorïa de las cuales son indeseables desde la perspectiva agronïmica (Klee et al., Genes Devel 1: 86-96, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990) . Por lo tanto, el principal problema con los mïtodos que se basan en la sïntesis incrementada de auxina es un problema de contenciïn, a saber confinar los efectos de la auxina a la raïz. Este problema probablemente no se supera por el uso de promotores especïficos del tejido: las auxinas se transportan en la planta y su acciïn consecuentemente no estï confinada al sitio de la sïntesis. Otro aspecto es si las auxinas siempre mejorarïn la biomasa total de las raïces. Para plantas cultivadas sobre agar, se ha notado que las concentraciones crecientes estimulaban progresivamente la formaciïn de raïces laterales pero inhibïan concurrentemente el crecimiento de estas raïces (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) .

Los problemas anteriormente mencionados en cuanto a la contenciïn de los efectos de la auxina y el mantenimiento del sobrecrecimiento de las raïces se resuelven mediante las realizaciones de las reivindicaciones de la patente.

Resumen de la Invenciïn La presente invenciïn se relaciona con una materia objeto como se define en las reivindicaciones adjuntas 1 a 10.

La presente especificaciïn describe una construcciïn genïtica que comprende un gen que codifica una proteïna con actividad de citoquinina oxidasa de la Arabidopsis thaliana. Este gen se expresa bajo el control de un promotor regulado. Este promotor puede ser regulado por factores endïgenos especïficos del tejido o especïficos del ambiente, o alternativamente puede ser inducido por la aplicaciïn de productos quïmicos especïficos.

La presente especificaciïn tambiïn describe una cïlula o planta que contiene la construcciïn genïtica.

La presente invenciïn se relaciona con un mïtodo para modificar la arquitectura y biomasa de las raïces mediante la expresiïn de un gen de oxidasa citoquinina bajo control de un promotor que es especïfico para la raïz o para ciertos tejidos o tipos de cïlulas de la raïz.

Descripciïn Detallada de la Invenciïn Para obviar los problemas mencionados anteriormente asociados con el incremento de la biosïntesis de auxina, se decidiï seguir un mïtodo alternativo. Nuestro razonamiento es que una regulaciïn por disminuciïn de los antagonistas biolïgicos de las auxinas podrïa evocar efectos similares o incluso superiores... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para estimular el crecimiento de la raïz o para potenciar la formaciïn de raïces laterales o adventicias

o para alterar el geotropismo radicular que comprende expresiïn en plantas o partes de plantas de un ïcido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta seleccionado del grupo que consiste de:

(a) ïcidos nucleicos que comprenden una secuencia de ADN como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas,

(b) ïcidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN que corresponden a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o el complemento de las mismas,

(c) ïcidos nucleicos que se hibridan especïficamente a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o al complemento de las mismas,

(d) ïcidos nucleicos que codifican una proteïna que comprende la secuencia de aminoïcidos como se da en la SEQ ID NO 2, o el complemento de las mismas,

(e) ïcidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ïcido nucleico es ADN, ADN genïmico, ADNc, ADN o ARN sintïtico en donde T se reemplaza por U,

(f) un ïcido nucleico que se degenera a un ïcido nucleico como se da en cualquiera de las SEQ ID NOs 1 o 25, o que se degenera a un ïcido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e) como resultado del cïdigo genïtico,

(g) ïcidos nucleicos que son divergentes de un ïcido nucleico que codifica una proteïna como se da en la SEQ ID NO 2 o que es divergente de un ïcido nucleico como se define en cualquiera de (a) a (e) , debido a las diferencias en el uso de codïn entre los organismos,

(h) ïcidos nucleicos que codifican una proteïna como se da en la SEQ ID NO 2 o ïcidos nucleicos como se define en (a) a (e) que son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

(i) ïcidos nucleicos que codifican una proteïna como se da en la SEQ ID NO 2, y

(j) fragmentos funcionales de ïcidos nucleicos como se define en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biolïgica de una citoquinina oxidasa.

2. Un mïtodo de la reivindicaciïn 1, dicho mïtodo lleva a un aumento en el rendimiento.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 1 en donde ocurre dicha expresiïn de dicho ïcido nucleico bajo el control de un promotor constitutivo fuerte o bajo el control de un promotor que se expresa preferiblemente en raïces.

4. Uso de una molïcula de ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1, un vector de expresiïn que comprende un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 enlazado de forma operativa a una o mïs secuencias de control que permiten la expresiïn de dicho ïcido nucleico en cïlulas anfitrionas procariotas y/o eucariotas, un polipïptido codificable por un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1, o un homïlogo o un derivado del mismo o un fragmento funcional del mismo, para incrementar la biomasa de raïz o para estimular el crecimiento de la raïz o para potenciar la formaciïn de raïces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular; en donde dicho homïlogo, derivado o fragmento funcional tiene actividad de citoquinina oxidasa.

5. Un mïtodo para incrementar el tamaïo del meristemo de la raïz o para incrementar el tamaïo de la raïz que comprende la expresiïn de un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raïces.

6. Un mïtodo para alterar senescencia de hojas que comprende la expresiïn de un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 en hojas con senescencia.

7. Un mïtodo para mejorar la capacidad de las plïntulas para mantenerse erguidas que comprende la expresiïn de un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 en plïntulas, preferiblemente en las raïces de plïntulas.

8. Un mïtodo para incrementar ramificaciïn de brote que comprende la expresiïn de un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 en plantas o partes de plantas.

9. Un mïtodo para mejorar resistencia al alojamiento que comprende la expresiïn de un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o yemas axilares.

10. Un mïtodo para estimular el crecimiento y desarrollo de la raïz que comprende la expresiïn de un ïcido nucleico como se define en la reivindicaciïn 1 en una cïlula transgïnica de planta o cultivo de tejido.