MÉTODO PARA MEJORAR LA ESTABILIDAD Y LA DURACIÓN DE CONSERVACIÓN DE COMPLEJOS DE LIPOSOMAS.

Un método de preparación de un complejo estable de selección como objetivo de células que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico,

gen indicador o agente diagnóstico que comprende: proporcionar un complejo que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente diagnóstico, gen indicador o agente terapéutico; combinar dicho complejo liposómico con una disolución acuosa que consiste esencialmente en una cantidad estabilizante de sacarosa en agua o en un tampón hasta una concentración final de alrededor de un 1% a alrededor de un 80% de sacarosa; liofilizar dicha disolución de complejo liposómico y sacarosa para obtener una preparación liofilizada; en el que, tras la reconstitución, dicha preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/017695.

Solicitante: GEORGETOWN UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 37TH AND "O" STREETS, N.W. WASHINGTON, D.C. 20057 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CHANG,ESTHER,H, PIROLLO,KATHLEEN,F.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 4 de Junio de 2004.

Fecha Concesión Europea: 11 de Agosto de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K47/48W6D
  • A61K48/00D2
  • A61K49/00F
  • A61K9/127B2
  • A61K9/127P
  • A61K9/19 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 9/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por un aspecto particular. › liofilizados.
  • C12N15/88 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › utilizando la micro-encapsulación, p. ej. utilizando vesículas liposómicas.

Clasificación PCT:

  • A61K49/00 A61K […] › Preparaciones para examen in vivo.
  • A61K9/127 A61K 9/00 […] › Liposomas.

Clasificación antigua:

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.


Fragmento de la descripción:

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. número 60/475.500, presentada el 4 de junio de 2003, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Campo de la Invención

Esta invención se refiere a un método de preparación de un complejo estable que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico o diagnóstico.

Antecedentes de la Invención

Los liposomas catiónicos están compuestos de bicapas lipídicas cargadas positivamente, y se pueden complejar con ADN desnudo cargado negativamente mediante la mezcla simple de los lípidos y el ADN, de forma que el complejo resultante tiene una carga neta positiva. El complejo se puede unir a células, y puede ser absorbido por las células en cultivo con una eficacia de transfección moderadamente buena. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos son seguros y eficaces para la administración de genes in vivo.

Se pueden usar liposomas para seleccionar como objetivo células tumorales modificando los liposomas de forma que administren selectivamente su carga a las células tumorales. Se pueden usar moléculas superficiales para dirigir los liposomas a las células tumorales debido a que el tipo y/o el número de moléculas que revisten el exterior de las células tumorales difieren de los de las células normales. Por ejemplo, si un liposoma tiene una molécula de folato o transferrina (Tf) en su superficie, se dirigirá a las células cancerosas que tengan niveles del receptor de folato o de transferrina que sean superiores a los de las células normales.

Además del uso de ligandos que son reconocidos por los receptores de las células tumorales, también se pueden unir anticuerpos específicos a la superficie de los liposomas, lo que les permite dirigirse hacia antígenos superficiales tumorales específicos (que incluyen, pero sin limitación, los receptores). Estos "inmunoliposomas" pueden administrar fármacos terapéuticos a una población celular específica. Se ha descubierto, por ejemplo, que los fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal (Mab) anti-HER-2 conjugados a liposomas se podrían unir de forma específica a una línea de células de cáncer de mama, S-BR-3, que sobreexpresa HER-2 (Park, J.W., et al. PNAS 92:1327-1331 (1995)). Se descubrió que los inmunoliposomas se interiorizaban de forma eficaz, y el anclaje de los fragmentos Fab anti-HER-2 aumentó sus efectos inhibitorios. La combinación de liposomas catiónicos-transferencia génica y las técnicas con inmunoliposomas parece ser un sistema prometedor para la terapia génica dirigida.

Se ha descrito en la técnica un sistema de administración liposomal dirigida por ligandos para la terapia génica con ADN que posee una selección como objetivo de tumores y una eficacia de transfección elevada. Xu, L., et al. Human Gene Therapy 8:467-475 (1997); Xu, L., et al., Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999); y Xu, L., et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999). Este sistema se ha mejorado por medio del uso de un fragmento de anticuerpo de cadena simple anti-receptor de transferrina (TfRscFv) como ligando de selección del objetivo en el complejo (Xu, L., et al. Molecule Medicine 7:723-734 (2001); Xu, L., et al. Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)). El TfRscFv se forma conectando los dominios variables VH y VL componentes de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente, con un péptido ligador diseñado de forma apropiada. El ligador enlaza el extremo C-terminal de la primera región variable y el extremo N-terminal de la segunda, ordenadas como VH-ligador-VL

o VL-ligador-VH. El sitio de unión de un scFv puede reproducir tanto la afinidad como la especificidad del sitio de unión de su anticuerpo original.

Los tratamientos convencionales del cáncer implican los tratamientos con quimioterapia y/o con radiación. La incorporación de estas terapias convencionales del cáncer en un componente nuevo que da como resultado la sensibilización de los tumores a la quimioterapia o a la radioterapia tendría una gran importancia clínica, disminuyendo las dosis eficaces de ambos tipos de modalidades anti-cancerosas y reduciendo de forma correspondiente los efectos secundarios graves asociados a menudo a estos tratamientos.

Los estudios iniciales con complejos liposómicos, tal como se describió anteriormente, han demostrado que los complejos son eficaces en la administración de agentes diagnósticos o terapéuticos a las células seleccionadas como objetivo. Es poco factible administrar los complejos a un paciente inmediatamente tras su preparación. Sería deseable proporcionar complejos liposómicos con selección del objetivo que tras la liofilización y el almacenamiento a 2-8 °C, -20 °C o -80 °C sigan siendo estables durante al menos seis meses, y que se puedan reconstituir sin una pérdida significativa de actividad.

Los informes previos han indicado que se podría liofilizar un complejo de dos componentes (lípido y ADN pero sin ligando o proteínas de selección del objetivo) en presencia de mono-o di-sacáridos, y todavía mantendría su actividad biológica y un tamaño de partícula apropiado para la terapia génica (Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) y Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000)). Además, la Tf unida por medio de PEG a un poliplex PEI-ADN mantuvo cierta actividad biológica después de la congelación y la descongelación (Kursa, M. et al., Bioconjugate Chemistry 14:222-231 (2003)). Es importante indicar que este complejo no se liofilizó, no se proporcionó ninguna indicación de la duración o de las condiciones de almacenamiento, y se añadió un carbohidrato (glucosa), si se incluyó, tras la descongelación. Este complejo polimérico requiere que la Tf esté unida al polímero por medio de una molécula de PEG. La patente de EE.UU. nº 5.811.406 describe complejos polinucleotídicos estabilizados añadiendo un compuesto crioprotector y liofilizando la formulación resultante. Esta referencia no describe un liposoma con un ligando de selección del objetivo, ni un complejo de selección como objetivo de células liofilizado tal como se describe en la presente memoria.

Sumario de la Invención

Un método para preparar un complejo estable que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico o diagnóstico o gen indicador comprende:

combinar un complejo que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente diagnóstico o terapéutico o un gen indicador con una disolución que comprende una cantidad estabilizante de sacarosa tal como se describe en la reivindicación 1; y

liofilizar la disolución resultante de complejo y de sacarosa para obtener una preparación liofilizada;

en el que, tras la reconstitución, la preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización.

En una realización preferida, la preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización, y más preferiblemente, al menos alrededor de un 90% de su actividad pre-liofilización.

Breve Descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra el tamaño (nm) de complejos recién preparados y liofilizados (Tf-LipA-Luc y TfRscFv-LipA-Luc) que contienen un 5% de dextrosa o un 5% de sacarosa.

Las Figuras 2A y 2B muestran la eficacia de transfección in vitro, proporcionada como unidades relativas de luz (URL) por ºg de proteína, de complejos recién preparados y liofilizados (Tf-LipA-Luc y TfRscFv-LipA-Luc) que contienen un 5% de dextrosa

o un 5% de sacarosa en células de próstata DU145 humanas.

La Figura 3 muestra la comparación de la eficacia de transfección in vitro de complejo TfRscFv-LipA-Luc recién preparado y liofilizado (URL/ºg de proteína) que contiene un 5% o un 10% de sacarosa en células de cáncer de próstata DU145 humanas.

Las Figuras 4A y 4B, respectivamente, muestran la selección como objetivo de tumores por xenoinjerto de DU145 de próstata y de PANCI de páncreas mediante complejos ligando-liposoma-ADN plasmídico liofilizados.

La Figura 5 demuestra en un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de próstata humano (DU145) que la capacidad de selección como objetivo de tumores de un complejo TfRscFv-LipA-p53 preparado en el laboratorio con un 10% de sacarosa se mantiene...

 


Reivindicaciones:

1. Un método de preparación de un complejo estable de selección como objetivo de células que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico, gen indicador o agente diagnóstico que comprende:

proporcionar un complejo que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente diagnóstico, gen indicador o agente terapéutico;

combinar dicho complejo liposómico con una disolución acuosa que consiste esencialmente en una cantidad estabilizante de sacarosa en agua o en un tampón hasta una concentración final de alrededor de un 1% a alrededor de un 80% de sacarosa;

liofilizar dicha disolución de complejo liposómico y sacarosa para obtener una preparación liofilizada; en el que, tras la reconstitución, dicha preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha disolución consiste esencialmente en sacarosa en un tampón PBS, en un tampón HEPES, en un tampón TRIS o en un tampón TRIS/EDTA.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha preparación mantiene al menos alrededor de un 85% o al menos alrededor de un 90%

o al menos alrededor de un 95% de su actividad pre-liofilización tras la reconstitución.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho complejo se combina con una disolución de sacarosa hasta una concentración final de alrededor de un 1% a alrededor de un 80%, o de alrededor de un 1% a alrededor de un 50%, o de alrededor de un 1% a alrededor de un 20%, o de alrededor de un 5% a alrededor de un 10%, o alrededor de un 10% de sacarosa.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ligando comprende un ligando cuyo receptor se expresa en forma diferencial en una célula seleccionada como objetivo.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ligando es una proteína.

7. El método de la reivindicación 5, en el que dicho ligando comprende transferrina, folato, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho ligando comprende un anticuerpo anti-TfR.

9. El método de la reivindicación 7, en el que dicho ligando comprende un fragmento Fv de cadena simple de un anticuerpo.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho fragmento de anticuerpo comprende un scFv basado en un anticuerpo anti-TfR.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho liposoma comprende al menos un lípido catiónico y al menos un lípido neutro o auxiliar.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicho lípido catiónico comprende fosfato de dioleoiltrimetilamonio (DOTAP) o bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), y dicho lípido neutro o auxiliar comprende dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o colesterol (col).

13. El método de la reivindicación 11, en el que dicho liposoma comprende una mezcla de DOTAP y DOPE.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el liposoma está unido a un péptido de al menos alrededor de 10 aminoácidos, en el que dicho péptido está compuesto de alrededor de un 5-100% de residuos de histidina y un 0-95% de residuos que no son histidina.

15. El método de la reivindicación 14, en el que al menos un 10% de dichos residuos que no son histidina de dicho péptido son residuos de lisina.

16. El método de la reivindicación 15, en el que dicho péptido tiene la estructura 5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho agente terapéutico comprende un gen, ADN plasmídico, oligonucleótido, oligodesoxinucleótido, oligonucleótido complementario o siARN.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho agente diagnóstico comprende un material denso en electrones, agentes de formación de imágenes mediante resonancia magnética o radiofármacos.

19. Una preparación liofilizada que comprende un complejo de un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico, o gen indicador o agente diagnóstico, que es estable a una temperatura en el intervalo de alrededor de -80 °C a 8 °C durante al menos alrededor de seis meses, a la vez que mantiene al menos alrededor de un 80% de actividad, y dicha preparación comprende dicho complejo y alrededor de un 1% a alrededor de un 80% de sacarosa para incrementar la estabilidad de dicho complejo.

20. La preparación liofilizada de la reivindicación 19, que comprende de alrededor de un 1% a alrededor de un 50%, o de alrededor de un 1% a alrededor de un 20%, o de alrededor de un 5% a alrededor de un 10%, o alrededor de un 10% de sacarosa.

21. La preparación liofilizada de la reivindicación 19, que tras la reconstitución mantiene al menos alrededor de un 80% o alrededor de un 85% o alrededor de un 90% o alrededor de un 95% de su actividad pre-liofilización.

22. La preparación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que dicho ligando, dicho agente terapéutico, dicho agente diagnóstico, y dicho liposoma son como se definieron en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 18.

 

Patentes similares o relacionadas:

Nanopartículas estabilizadas con composiciones de ácido nitrofenilborónico, del 15 de Julio de 2020, de CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY: Una nanopartícula que comprende un polímero que contiene un poliol y un polímero que contiene un ácido nitrofenilborónico, en donde el polímero que contiene […]

Composiciones y métodos para la administración de ácidos nucleicos a base de nanopolímeros, del 23 de Octubre de 2019, de MARINE POLYMER TECHNOLOGIES, INC.: Una composición de nanopartícula de poli-N-acetilglucosamina/ácido nucleico para uso en un método para tratar o prevenir el cáncer, una enfermedad […]

Moléculas de ARN protegidas y no protegidas y copolímeros de bloques para la administración intracelular de ARN, del 11 de Septiembre de 2019, de INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM): Un copolímero de bloques anfifílico no iónico tetrafuncional, para uso en un método para el suministro intracelular de un ARNm protegido o no protegido […]

Métodos y composiciones para administración de ácidos nucleicos, del 7 de Agosto de 2019, de THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA: Una partícula de lípido que comprende un primer lípido catiónico, un segundo lípido catiónico, un lípido neutro, y un lípido PEG capaz de reducir la agregación; en donde […]

Inmovilización reversible y/o liberación controlada de ácidos nucleicos contenidos en nanopartículas mediante revestimientos poliméricos (biodegradables), del 11 de Julio de 2019, de CureVac AG: Nanopartículas que comprenden o consisten en un complejo de un ácido nucleico, que es ADN o ARN, y una molécula portadora polimérica de fórmula genérica (I): […]

Suministro de genes mediado por nanopartículas, edición genómica y modificación que fija como objetivo ligandos en diversas poblaciones de células, del 8 de Julio de 2019, de RENSSELAER POLYTECHNIC INSTITUTE: Una nanopartícula, que comprende: un poliplexo de núcleo y un recubrimiento de sílice sobre el mismo, en donde dicho poliplexo de núcleo comprende: uno o más polímeros […]

Administración de ARN autorreplicante utilizando partículas de polímeros biodegradables, del 8 de Mayo de 2019, de GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA: Una composición inmunogénica que comprende (a) nanopartículas cargadas positivamente que comprenden un polímero biodegradable y un tensioactivo catiónico, en la que el polímero […]

Método de transfección de células, del 14 de Marzo de 2019, de COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION: Un método para producir un ave que comprende células germinales modificadas genéticamente, método que comprende: (i) inyectar una mezcla de transfección que […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .