Método in vitro de pronóstico de fibrosis hepática grave.

Método in vitro de pronóstico de fibrosis hepática grave.

La presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico de fibrosis hepática grave en hepatitis C crónica caracterizado por la detección del polimorfismo genético rs3778216 del gen HDAC2 o cualquiera que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él.

También se refiere a un método in vitro para el pronóstico y/o diagnóstico de dicha patología que se caracteriza por la detección de dichos polimorfismos y la determinación de variables clínicas o de otros polimorfismos. La presente invención se refiere también a uso del polimorfismo rs3778216 del gen HDAC2 o cualquiera que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él como marcador pronóstico de fibrosis hepática grave y también al uso de un kit que comprende sondas para su detección.

Método in vitro de pronóstico de fibrosis hepática grave.

La presente invención se refiere a un método in vitro de pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave para enfermedades crónicas del hígado, preferentemente hepatitis crónica C, que se caracteriza por la detección del polimorfismo genético rs3778216 del gen HDAC2 o cualquiera que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con él (r20, 8) . La inclusión de la determinación de una variable clínica, preferentemente la determinación de la concentración de la aspartato aminotransferasa (AST) , en una muestra biológica aislada permite el diagnóstico de fibrosis hepática F>2 en pacientes con hepatitis crónica C. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La fibrosis hepática es una patología que se caracteriza por acumulación excesiva de matriz extracelular en el parénquima hepático que conlleva una alteración estructural y funcional de este órgano. La fibrosis hepática es común en enfermedades crónicas del hígado como son la hepatitis causada por el virus de la hepatitis C, la hepatitis causada por el virus de la hepatitis B, la enfermedad de hígado graso no alcohólica y la enfermedad hepática alcohólica (Poynard, T. y cols. Adv Clin Chem 2008, 46:131-160) .

La infección por virus de la hepatitis C (VHC) es una de las principales causas de enfermedad hepática crónica mundial, afectando aproximadamente a 170 millones de personas (Brown, R.S. Nature 2005, 436:973–978.) . La actual terapia antiviral consiste en interferón alfa pegilado más ribavirina; sin embargo, se observa una alta variabilidad en la tasa de respuesta obtenida con este tratamiento. Esta variabilidad se asocia tanto a factores virales como factores del paciente.

Uno de los factores virales más importantes es el genotipo viral. Así la erradicación del virus de la hepatitis C es especialmente difícil en los pacientes infectados por genotipo viral 1, alcanzando una tasa de respuesta cercana al 50% de los pacientes tratados mientras que los pacientes con genotipos virales 2 y 3 responden un 70% aproximadamente.

Entre los factores del paciente que influyen en el resultado del tratamiento antiviral se incluyen el sexo, la edad o el índice de masa corporal. Además, se han descrito recientemente distintos polimorfismos en el gen IL-28B, que codifica para el interferón A3, que influyen muy significativamente en la respuesta al tratamiento, remarcando la importancia del perfil genético del paciente en la respuesta a estos fármacos (Suppiah, V. y cols. Nat Genet 2009, 41 (10) :1100-4. Tanaka, Y. y cols. Nat Genet 2009, 41 (10) :1105-9. Ge, D. y cols. Nature 2009, 461 (7262) :399-401) .

El fracaso de la terapia tiene importantes repercusiones clínicas debido a que esta enfermedad evoluciona frecuentemente a fibrosis, pudiendo desencadenar en cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC) , de costoso manejo y que constituyen la principal causa de trasplante hepático. De forma similar a la respuesta al tratamiento, la progresión y pronóstico de la hepatitis crónica C (HCC) es muy variable entre los distintos pacientes, indicando la relevancia de la variabilidad genética interindividual en la etiopatogenia de la HCC.

El diagnóstico de la fibrosis hepática tradicionalmente se realiza a partir de una biopsia hepática. La escala METAVIR, permite valorar el grado de fibrosis hepática clasificado en 5 estadios (Bedossa, P., Poynard, T. Hepatology 1996, 24 (2) :289-293) : fibrosis ligera o ausente (hígado sin fibrosis o fibrosis portal sin septos lobares, F0 y F1) , fibrosis moderada (fibrosis portal con pocos septos, F2) , fibrosis grave (numerosos septos incompletos con distorsión de la arquitectura hepática, pero sin cirrosis, F3) , y cirrosis (F4) . Dependiendo del estadio, el pronóstico del paciente es mejor o peor, siendo el estadio de cirrosis (F4) el más grave. Sin embargo, esta técnica es invasiva, limitada por problemas de variabilidad debidos al tamaño de la biopsia, de interpretación subjetiva, difícil repetición periódica y de elevado coste económico. Por estos motivos, se necesitan test de diagnóstico no invasivos que puedan reemplazar la biopsia hepática basados en pruebas indirectas más seguras para el paciente y de menor coste socioeconómico.

Así se desarrollaron diversos índices como APRI o, más recientemente, FIB-4, que combinan diversos marcadores fibrogénicos en sangre periférica en una relación simple (Wai, C.T. y cols. Hepatology 2003, 38 (2) :518-26. Sterling,

R.K. y cols. Hepatology 2006, 43 (6) :1317-25) . Posteriormente, se instauraron otros índices para diagnosticar la progresión de la enfermedad en el hígado y su gravedad, que incluían la medición y el análisis en funciones matemáticas (regresión logística) de los niveles de dichos marcadores biológicos junto a otras variables clínicas para proporcionar una puntuación de fibrosis, como Fibrotest, ELF, Fibrometer, Fibrospect, y Hepascore (Imbert-Bismut,

F. y cols. Lancet 2001, 357 (9262) :1069-75. Rosenberg, W.M. y cols. Gastroenterology 2004, 127 (6) :1704-13. Cales,

P. y cols. Hepatology 2005, 42 (6) :1373-81. Patel, K. y cols. J Hepatol 2004, 41 (6) :935-42. Adams, L.A. y cols. Clin Chem 2005, 51 (10) :1867-73.) , entre otros (para una revisión de todos estos métodos ver Pinzani, M. Hepatology 2011, 54 (4) :1476-7) . A pesar de la validez de estas escalas para diagnosticar la fibrosis hepática, recopilado en un metanálisis reciente, se sigue proponiendo la necesidad de la biopsia hepática para discriminar determinados estadios de fibrosis (Poynard, T. y cols. Advances in Clinical Chemistr y 2008, 46:131-156) .

Por otra parte, se han desarrollado otros sistemas no invasivos para el diagnóstico de la fibrosis hepática mediante métodos físicos, por ejemplo elastometría ecográfica, que evalúa la rigidez del hígado (LSE) . Sin embargo, la tasa de errores de clasificación utilizando un único punto de corte de rigidez hepática impide su aplicación para detectar a los pacientes con ausencia de fibrosis o fibrosis mínima. Además, esta técnica no está disponible en todos los centros sanitarios debido a su coste, y al hecho de que en algunos países no se ha validado como método diagnóstico.

Recientemente, se ha propuesto que la combinación de diversos biomarcadores de fibrosis, marcadores clínicos y demográficos, junto a los resultados obtenidos de las pruebas de imagen (como el Fibroscan™ o ARFI) pueden abolir la necesidad de la biopsia para diagnosticar la presencia y/o gravedad de la patología hepática en la mayoría de los casos, más aún para determinados estadios de fibrosis (Cales, P. y Boursier, J. WO 2010/097472) .

A pesar de los diversos métodos comentados para diagnosticar la gravedad de la fibrosis hepática en los pacientes con HCC, la disponibilidad de test capaces de evaluar la predisposición de un paciente para desarrollar fibrosis es todavía muy limitada. Aunque la hepatitis crónica C es una enfermedad de evolución lenta, que requiere décadas para progresar a fibrosis avanzada en la mayoría de los casos, existe un subgrupo de pacientes que presenta una tasa de progresión más rápida, según ha sido descrito en la literatura (Seeff, L.B. Liver Int 2009, 29:89–99. Marcellin,

P. y cols. Hepatology 2002, 36: S47–56) . La variabilidad en la tasa de evolución de esta enfermedad entre los distintos pacientes refleja la gran utilidad clínica de la identificación de marcadores genéticos de riesgo a la hora de establecer criterios terapéuticos que minimicen costes y efectos adversos. Además, los factores de riesgo identificados hasta la fecha sólo explican el 30% de los casos que progresan a fibrosis grave y cirrosis, lo que indica la importancia del perfil genético de los pacientes a la hora de desarrollar cirrosis y/o CHC con mayor o menor celeridad.

En este sentido, se han caracterizado diversos polimorfismos de un único nucleótido (SNPs) en genes implicados en la regulación de la respuesta inmune para el VHC (IFN, TNF, IL-10, LDL, MCP-2) , asociados a la progresión de fibrosis en pacientes con HCC (Missiha, S.B. y cols. Gastroenterology 2008, 134 (6) :1699-714. Bataller, R. y cols. Hepatology 2003, 37 (3) :493-503. Powell, E.E. y cols. Hepatology 2000, 31 (4) :828-33. Romero-Gómez, M. y cols. Liver Int. 2011, 4:443-460) . No obstante, estos estudios han suscitado una importante controversia debido a que muchos de ellos han sido realizados en cohortes pequeñas de pacientes y no han podido ser confirmados en series independientes. Recientemente, se ha descrito una región en el gen IFNGR2 (Nalpas, B. y cols. Gut 2010, 59:11201126) , que incluye distintos polimorfismos (rs9976971,... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave caracterizado por la detección de al menos un polimorfismo genético del gen HDAC2 seleccionado de la lista que comprende: rs3778216, rs13209064, rs13213007, rs13201727, rs13216873, rs13194921, rs13204434, rs12665655, rs13204445, rs12660414, rs2025191, rs1322453 y rs13212298 en la muestra biológica aislada de un sujeto que padece hepatitis crónica C.

2. Método según la reivindicación 1 que además comprende asociar el genotipo G/G del polimorfismo genético rs3778216, el genotipo A/A del polimorfismo genético rs13212298, el genotipo C/C del polimorfismo genético rs12665655, el genotipo A/A del polimorfismo genético rs13204445, el genotipo T/T el polimorfismo genético rs13204434, el genotipo A/A del polimorfismo genético rs13194921, el genotipo T/T del polimorfismo genético rs13209064, el genotipo C/C del polimorfismo genético rs13213007, el genotipo T/T del polimorfismo genético rs13216873, el genotipo G/G del polimorfismo genético rs12660414, el genotipo T/T del polimorfismo genético rs2025191, el genotipo A/A del polimorfismo genético rs13201727, o el genotipo C/C del polimorfismo genético rs1322453 del gen HDAC2 a un pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde el polimorfismo genético del gen HDAC2 es rs3778216.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde además se detectan los niveles de aspartato aminotransferasa (AST) .

5. Método según la reivindicación 4 donde la asociación a un diagnóstico de fibrosis hepática grave se obtiene si los valores de AST son superiores a 40 U/L.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 donde la asociación a un pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave se obtiene si la edad del paciente es superior a 40 años.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde además se detecta al menos un polimorfismo genético del gen STAT1 seleccionado de la lista que comprende: rs2030171, rs13029247, rs10173099, rs10199181, y rs6745710.

8. Método según la reivindicación 7 donde la asociación a un pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave se obtiene cuando además el sujeto es portador del genotipo G/G del polimorfismo genético rs2030171, del genotipo T/T del polimorfismo genético rs13029247, del genotipo C/C del polimorfismo genético rs10173099, del genotipo T/T del polimorfismo genético rs10199181, o del genotipo C/C del polimorfismo genético rs6745710 del gen STAT1.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde el polimorfismo genético del gen STAT1 es rs2030171.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde además se detecta al menos un polimorfismo genético del gen ISGF3G o del gen TM9SF1 seleccionado de la lista que comprende: rs12436555, rs12432194 y rs10583 para el pronóstico y/o diagnóstico de la fibrosis.

11. Método según la reivindicación 10 donde la asociación a un pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave en el paso (b) se obtiene cuando además el sujeto es portador del alelo A del polimorfismo genético rs12436555 o del alelo T del polimorfismo genético rs12432194 del gen ISGF3G, o del alelo A del polimorfismo genético rs10583 del gen TM9SF1.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde el polimorfismo genético del gen ISGF3G es rs12436555.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la muestra biológica se selecciona de la lista que comprende tejido, mucosa oral, sangre, plasma, suero y linfa.

14. Método según la reivindicación 13 donde la muestra biológica es sangre.

15. Método según las reivindicaciones 1 a 14 donde la detección del polimorfismo se realiza mediante sondas de hibridación marcadas con fluoróforos.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde el sujeto es un humano.

17. Uso de un kit que comprende las sondas SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 que detectan el polimorfismo genético rs3778216 del gen HDAC2 para la obtención de datos útiles para el pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave en un sujeto que padece hepatitis C crónica.

18. Uso de un kit según la reivindicación 17 que además comprende las sondas SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9 que detectan el polimorfismo genético rs2030171 del gen STAT1, y/o las sondas SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12 que detectan el polimorfismo genético rs12436555 del gen ISGF3G.

19. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 donde el sujeto es un humano.

FIG.1

FIG.2 A FIG.2 B

FIG.2 C